В опухолевых клетках происходит снижение сульфатирования ГАГ: в клетках карциномы желудка в 10 раз увеличивается содержание несульфатированных дисахаридных единиц, однако происходит увеличение сульфатирования ХС и ДС цепей по 6-положению в 4 раза [55]. В клетках аденокарциномы кишечника увеличивается число несульфатированных единиц в 3 раза, в 3 раза уменьшается количество 4-сульфатированных единиц, увеличивается в 5 раз количество дисахаридных единиц, сульфатированных по 6-положению [58].
Для многих опухолей показано изменение соотношения ДС и ХС. В карциноме желудка увеличивается содержание ХС по сравнению с нормой в 4 раза [55], в карциноме поджелудочной железы содержание ХС увеличивается в 22 раза [56], в клетках карциномы гортани - в 5 раз [59], в аденокарциноме кишечника - в 11 раз [58]. Для опухоли прямой кишки показано, что содержание хондроитинсульфатов увеличивается с 27% до 70% [57], в карциноме молочной железы содержание ХС увеличивается на 32,2 % [60].
Наряду с увеличением содержания хондроитинсульфатов происходит снижение содержания дерматансульфатов, характерных для покоящихся тканей.
Для опухоли прямой кишки показано, что содержание дерматансульфатов падает с 73% до 30% [57], в карциноме молочной железы содержание ДС снижается на 18,5 % [60].
Показано, что изменяется структура ПГ в опухолевых клетках - в лейомиоме количество остатков L-идуроновой кислоты уменьшается по сравнению с нормой с 55% до 45% [61].
Декорин относится к классу дерматансульфат протеогликанов и является членом семейства маленьких лейцин-богатых протеогликанов.
К коровому белку декорина ковалентно присединена одна цепь ДС или ХС.
Декорин известен как секретируемый протеогликан, экспрессируемый широким кругом тканей мезенхимального происхождения, включая опухолевую строму, но не трансформированными клетками.
Декорин участвует в регуляции таких клеточных функций, как пролиферация, адгезия и миграция.
Декорин способен связываться с компонентами внеклеточного матрикса - фибронектином, тромбоспондином и несколькими типами коллагена, регулируя фибриллогенез последнего. Коровый белок декорина взаимодействует с TGF- и является ингибитором этого цитокина. Декорин также может напрямую тормозить клеточную пролиферацию [62].
Показано, что декорин участвует в целом ряде механизмов, регулирующих пролиферацию клеток:
· взаимодействует с рецептором эпидермального фактора роста [63] (EGFR) и запускает сигнальный каскад, приводящий к увеличению экспрессии белка р21, что приводит к супрессии циклина, подавлению активности циклин-зависимых киназ [64] и торможению клеточного деления [65];
· ингибирует биологическую активность фактора роста TGF- [66]. TGF- может влиять на рост опухоли, опосредовать устойчивость к лекарствам, усиливать ангиогенез в опухоли [67]. Декорин присоединяется к связывающему домену TGF-, предотвращая его связывание с рецептором, что приводит к торможению клеточного деления [68];
· подавляет экспрессию и биосинтез эндотелиального фактора роста сосудов (VEGF), что приводит к супрессии ангиогенеза в опухолевой ткани [69];
· вызывает функциональную инактивацию онкогенного белка ErbB2, ингибируя тем самым рост клеток и стимулируя их дифференцировку [68];
· влияет на жизнеспособность клеток через Akt/протеинкиназа В-зависимый и - независимый механизмы, снижая апоптоз эндотелиальных клеток [70].
Для декорина доказана антимитотическая активность: добавление рекомбинантного декорина в культуру опухолевых клеток ингибировало их рост in vitro [71], экспрессия декорина denovoв культуре опухолевых клеток приводила к их возвращению к нормальному фенотипу [72]. Аденовирусная доставка декорина в растущую экспериментальную опухоль приводила к значительному ингибированию роста опухоли [73].
Целью описанных выше экспериментов являлось введение в опухолевую ткань недостающего декорина в той или иной форме (рекомбинантного белка либо генноинженерных конструкций).
Однако вопрос о причине снижения содержания декорина в трансформированных клетках до сих пор не поднимался.
Известно, что ключевым ферментом биосинтеза дерматансульфат протеогликанов (в том числе и декорина) является фермент D-глюкуронил С5-эпимераза [74]. Этот фермент проводит эпимеризацию глюкуроновой кислоты в идуроновую (рис.6) с образованием функционально активного декорина. Причем в экспериментах in vitro было показано, что этот процесс может быть обратимым [75], однако, после полной модификации ГАГ цепи обратная реакция невозможна [76].
Показана субстратная специфичность для D-глюкуронил С5-эпимеразы, выделенной из культуры клеток фибробластов - дерматан и хондроитин являются хорошими субстратами для этого фермента, тогда как их О-сульфатированные формы практически не подвергаются модификации [77]. Вероятно, эпимеризация уроновой кислоты в идуроновую происходит до О-сульфатирования ГАГ, и О-сульфатированные ГАГ не являются субстратом для D-глюкуронил С5-эпимеразы [78].
Известно, что для работы D-глюкуронил С5-эпимеразы мыши необходимы N-ацетильные группы на глюкозамине и определенное расположение N-сульфатных групп. Кроме того, существует прямая зависимость работы фермента от размера субстрата [79].
Процесс эпимеризации остатков глюкуроновой кислоты в идуроновую кислоту зависит от структуры корового белка [80].
Биосинтез протеогликанов изучен достаточно хорошо, большинство ферментов их биосинтеза клонированы. D-глюкуронил С5-эпимераза является единственным ферментом биосинтеза протеогликанов человека, который до сих пор не клонирован [17].
В настоящее время клонированы и охарактеризованы гены D-глюкуронил С5-эпимеразы быка [81] и мыши [82] - единственный ген D-глюкуронил С5-эпимеразы мыши находится в 9 хромосоме. Показано, что мышиная D-глюкуронил С5-эпимераза приблизительно одинаково экспрессируется в различных тканях: сердце, мозге, легких, печени, мышцах, почках. Исключением является селезенка, в которой экспрессия D-глюкуронил С5-эпимеразы понижена [82].
Показано, что разрушение гена, кодирующего D-глюкуронил С5-эпимеразу у мыши, приводило к гибели эмбриона (гетерозиготы погибали в течение года, гомозиготы по мутантному генотипу погибали сразу после рождения). У эмбрионов были обнаружены дефекты развития почек, легких, неправильное формирование скелета. В других жизненно важных органах и системах (мозге, печени, желудочно-кишечном тракте, коже) изменений обнаружено не было. Оказалось, что присутствие идуроновой кислоты необходимо для нормального развития почек, легких, скелета [83]. Также показано, что наличие ГС, содержащих остатки идуроновой кислоты необходимо для нормального развития различных типов нейронов [84].
Отсутствие публикаций по данным вопросам не позволяет сказать, есть ли какая-либо ткане - или видоспецифичность в экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы у человека и одинаковы ли экспрессия/активность этого фермента в нормальных и опухолевых тканях, существует ли связь между изменением состава ПГ и изменением экспрессии/активности D-глюкуронил С5-эпимеразы.
Регуляторная роль протеогликанов изучалась в лаборатории Структуры генома ИЦиГ СО РАН в течение ряда лет. Исследовались протеогликаны из различных типов клеток, был охарактеризован их состав и структурные особенности. В работах В.И. Рыковой и
Г.М. Роничевской с соавторами была показана антимитотическая активность ПГ, выделенных из препаратов суммарной клеточной РНК [85] и их влияние на синтез ДНК в клетке [31]. Изучался также состав протеогликанов в ядрах нормальных и трансформированных клеток [32]. Было показано, что при злокачественной трансформации в клетках снижается содержание дерматансульфат протеогликанов и возрастает содержание хондроитинсульфат протеогликанов - не полностью модифицированных предшественников ДСПГ [32]. Данные эксперименты велись на животных.
Поскольку ключевым ферментом биосинтеза дерматансульфатов в клетке является D - глюкуронил С5-эпимераза [74], то нашей группой было выдвинуто предположение, что причиной недостаточного синтеза дерматансульфат протеогликанов в клетках является пониженная экспрессия/активность фермента D-глюкуронил С5-эпимеразы.
В настоящее время в лаборатории Молекулярных механизмов канцерогенеза Института Молекулярной Биологии и Биофизики СО РАМН совместно с лабораторией Структуры генома ИЦиГ СОРАН ведется изучение взаимосвязи между уровнем экспрессии/активности D-глюкуронил С5-эпимеразы и составом протеогликанов в нормальной и опухолевой ткани молочной железы человека.
В рамках данного исследования в лаборатории Молекулярных механизмов канцерогенеза ведется работа по определению уровня экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в нормальной и опухолевой ткани молочной железы человека методами мультиплексной ПЦР и ПЦР в реальном времени.
Целью данной дипломной работы является изучение взаимосвязи состава протеогликанов в нормальной и опухолевой ткани молочной железы человека с экспрессией белковой молекулы D-глюкуронил С5-эпимеразы.
В соответствии с этой целью нами были поставлены следующие задачи:
1. Сравнить состав протеогликанов в контрольной и опухолевой ткани молочной железы человека;
2. Провести количественную оценку суммарных протеогликанов в контрольной и опухолевой ткани молочной железы человека;
3. Определить экспрессию дерматансульфат протеогликана декорина в контрольной опухолевой ткани молочной железы человека;
4. Определить экспрессию белковой молекулы D-глюкуронил С5-эпимеразы в тех же клинических образцах.