Нарушение экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы как возможная причина изменения структуры протеогликанов в опухоли молочной железы человека (стр. 8 из 12)
Позднее в работе стали использовать фирменный реактив Брэдфорда QuickStartBradfordDyeReagentи набор стандартных концентраций бычьего сывороточного альбумина QuickStartBovineSerumAlbuminStandardSet (BioRad).
Измерения проводили на спектрофотометре SPECOL21.
2.2.4.3 Определение концентрации нуклеиновых кислот
Осажденные хлорной кислотой нуклеиновые кислоты (см. п.2.2.1.) гидролизовали щелочью: к осадкам приливали по 50 мкл 0.5 Nгидроксид натрия и инкубировали при комнатной температуре в течение 17-20 ч. По окончании реакции пробы нейтрализовали 0.5 Nуксусной кислотой. Содержание нуклеиновых кислот определяли по поглощению раствора при 260 нм против раствора 0.5 Nацетата натрия.
Измерения проводили на спектрофотометре EppendorfBioPhotometer.
2.2.5 Вестерн-блот
Готовили гомогенат ткани: контрольную и опухолевую ткань молочной железы человека растирали в ступке с жидким азотом в буфере 50 мМ Трис-НСl, рН 7.5; 150 мМ NaCl; 1% IGEPAL; 1 таблетка ингибиторного коктейля ProteaseInhibitorCoctailTablets (RocheDiagnostics) на 10 мл буфера. Буфер добавляли из расчета 0.5 мл буфера на 100 мг ткани.
Проводили электрофоретическое разделение белков методом 2.2.6.2.
После проведения электрофореза гель вынимали, срезали концентрирующий гель, другие ненужные участки и левый верхний угол геля. Затем гель на 5 мин. заливали буфером для переноса (47.9 мМ Трис, 38.6 мМ глицин, 0.0385% SDS, 20% этанол). Вырезали нитроцеллюлозную мембрану (на 4-6 мм шире и длиннее геля) и 8 таких же по размеру листков фильтровальной бумаги. У мембраны также срезали левый верхний угол. Мембрану и фильтровальную бумагу тщательно смачивали буфером для переноса. Готовили сэндвич в последовательности: 4 листка фильтровальной бумаги, мембрана, гель, 4 листка фильтровальной бумаги. Закладывая сэндвич, следили, чтобы не образовывалось воздушных пузырей между его слоями. Сэндвич помещали между электродами трансблоттера. Перенос вели при токе 2 мА/см2 геля в течение 1 часа.
После переноса мембрану помещали (вверх стороной, на которую шел перенос) в ванночку с буфером для блокировки (5 % сухое обезжиренное молоко в PBS, 0.1 % твин-20). Качали 1 час на качающейся платформе. Запаивали мембрану в пленку с 7 мл раствора первичных антител (моноклональных АТ или поликлональной сыворотки) в буфере для блокировки. Первичные антитела разводили в соотношении 1: 1000. Качали 2 часа. Затем отмывали мембрану, качая в течение 5 мин. в ванночке с буфером для отмывки (PBS, 0.1 % твин-20). Процедуру повторяли трижды, каждый раз заливали свежий отмывочный раствор. Запаивали мембрану с 7 мл раствора соответствующих вторичных антител (меченных пероксидазой хрена) в буфере для блокировки. Вторичные антитела разводили в соотношении 1: 1000. Качали 1 час. Отмывали мембрану так же, как после гибридизации с первичными АТ.
Для проявления вестерна использовали набор реактивов ECLWesternBlottingAnalysisSystem (AmershamBiosciences). Все нижеперечисленные действия выполняли в темной комнате.
Мембрану вынимали из отмывочного раствора и помещали (вверх стороной, на которую шел перенос) на пленку SaranWrap. Смешивали по 1 мл растворов 1 и 2 из ECL-набора. Смесью равномерно заливали мембрану и выдерживали 1 мин. Быстро сливали проявочный раствор, мембрану заворачивали в пленку SaranWrap, помещали в кассету и сверху накладывали рентгеновскую пленку, экспонировали 1мин. и 3 мин. Затем рентгеновскую пленку погружали в раствор проявителя на 3 мин., промывали водой и погружали в раствор закрепителя на 3 мин. Пленку снова промывали водой и высушивали.
2.2.6 Электрофорез
2.2.6.1 Горизонтальный электрофорез в агарозном геле
Фракционирование ПГ проводили методом горизонтального гель-электрофореза в пластинах 1% агарозного геля толщиной 1 мм, 9х5см. Электрофорез вели в различных буферных системах (с целью выбрать, в каком буфере происходит наилучшее разделение ПГ на фракции): 50 мМ ацетат бария, рН 5 (электрофорез вели в течение 40 мин.); ТАЕ, рН 8 (7 мин.); 50 мМ ацетат бария, рН 8 (50 мин.) при напряжении 2.2 В/см2. Электрофорез проводили на холоду (камеру для электрофореза ставили в емкость со льдом). Перед нанесением на гель пробы смешивали в соотношении 10: 1 с 50% глицерином, содержащим 0.1 % бромфеноловый синий (буфер для нанесения). В качестве стандарта использовали смесь ГАГ: гепарин (1 мкг/мкл) + хондроитинсульфат В (1 мкг/мкл) + хондроитинсульфаты А и С (1 мкг/мкл). После электрофореза гель окрашивали 0.1% толуидиновым синим в 1% уксусной кислоте (для одновременной визуализации ПГ и нуклеиновых кислот: ПГ окрашиваются в фиолетовый цвет, нуклеиновые кислоты - в синий).
Гель отмывали от избытка красителя в 1% уксусной кислоте до прозрачного фона и высушивали на лавсановой пленке или предметном стекле.
2.2.6.2 Вертикальный электрофорез белков в полиакриламидном геле по Лэммли
Разделение белков, для последующего проведения вестерн-блота проводили методом ступенчатого электрофореза (по Лэммли).
Концентрирующий гель: 4% SDS-ПААГ. Гель полимеризовали в буфере 0.0625 М Трис-НСl, рН 6.8.
Разделяющий гель: 8% SDS-ПААГ. Гель полимеризовали в буфере 0.375 М Трис-НСl, рН 8.9.
Пробы перед нанесением кипятили в течение 5 мин. при 95оС в фирменном буфере для нанесения NuPageSDSSampleBuffer (Invitrogen). В карман наносили по 20 мкг белка. Концентрацию белка в гомогенате определяли по Брэдфорду (см. п.2.2.4.2.)
Электрофорез проводили в буфере 0.025 М Трис, 0.192 М глицин, 0.04 М SDS, рН 8.3 при напряжении 2 В/см2 в течении 4 - 4.5 часов.
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1 Выделение протеогликанов
Нашей первой задачей была отработка метода выделения протеогликанов из микроколичеств (100-1000 мг) клинического материала.
Объектом исследования являлась опухолевая и окружающая нормальная ткань молочной железы человека.
Окружающая опухоль ткань в нашем исследовании являлась контрольной.
Однако не исключено, что она могла подвергнуться предопухолевым изменениям (воспаление, мастопатия).
В процессе работы в методику выделения ПГ (см. п.2.2.1.), разработанную в нашей лаборатории, нами были внесены некоторые изменения.
От диализа растворов ПГ против воды отказались, как от излишней процедуры, когда было замечено, что при концентрировании проб бутанолом кислота уходит во фракцию бутанола, и pHраствора ПГ при этом становится нейтральным.
Диализ растворов против 50 мMацетата натрия заменили добавлением ацетата натрия до конечной 50 мMконцентрации в рабочий раствор ПГ. Данные изменения позволили значительно упростить и ускорить процедуру выделения ПГ.
Мы выяснили, что данным методом из имеющихся у нас образцов ткани выделяется достаточное для визуализации гель-электрофорезом количество ПГ (рис.9).
Рис.9. Электрофореграмма протеогликанов
1 - стандартная смесь ГАГ
2 - пациент № 70, контрольная ткань
3 - пациент № 70, опухолевая ткань
4 - пациент № 72, контрольная ткань
5 - пациент № 72, опухолевая ткань
В различных буферных системах качество и четкость разделения ПГ на фракции может варьировать. Нам необходимо было подобрать буферную систему, в которой происходит наилучшее разделение фракций ПГ.
3.2 Отработка условий проведения электрофореза протеогликанов в агарозном геле
Выделенные образцы протеогликанов разделяли электрофорезом в различных буферных системах и сравнивали по подвижности со стандартами ГАГ (рис.10).
В буфере ТАЕ электрофорез проходит очень быстро (7 мин.), стандарты и пробы не успевают разделиться. Наилучшее разделение ПГ на фракции происходило в буфере 50 мM ацетат бария, pH 5. В последующих экспериментах мы будем использовать именно этот буфер.
Таким образом, нами была отработана методика проведения гель-электрофореза протеогликанов, подобран оптимальный буфер для электрофореза.
А. электрофорез проводили в буфере 50 мMацетат бария, pH8, 40мин.
В. электрофорез проводили в буфере TAE, pH8, 7мин.
С. электрофорез проводили в буфере 50 мMацетат бария, pH5, 50мин.
Рис.10. Электрофореграмма ПГ, в различныхбуферных системах
1 - пациент № 40, лимфоузел
2 - пациент № 41, доброкачественная
опухоль молочной железы
3 - стандартная смесь ГАГ
3.3 Очистка препаратов протеогликанов от примесей нуклеиновых кислот
Известно, что в выделяемых препаратах ПГ часто присутствуют примеси нуклеиновых кислот (преимущественно РНК), которые мешают идентификации ПГ (окрашиваются теми же красителями, обладают сходной с ПГ подвижностью).
Примесь нуклеиновых кислот удаляли обработкой растворов протеогликанов щелочью или нуклеазами.
3.3.1 Обработка препаратов протеогликанов щелочью
При щелочной обработке препаратов протеогликанов (см. п.2.2.2.1.) происходит не только удаление примесей РНК, но и отделение ГАГ-цепей от белкового кора ПГ, и в этом случае с помощью гель-электрофореза (рис.11) мы анализируем только состав ГАГ в препарате.
Рис.11. Препараты протеогликанов до и после обработки щелочью
1 - пациент № 45, контрольная ткань
2 - пациент № 45, контрольная ткань + NaOH
3 - пациент № 45, опухолевая ткань
4 - пациент № 45, опухолевая ткань + NaOH
5 - пациент № 40, ткань лимфоузла
6 - пациент № 40, ткань лимфоузла + NaOH
После обработки препаратов ПГ щелочью стало ясно, что в них присутствовала значительная примесь нуклеиновых кислот, и дополнительная очистка препаратов необходима.
Однако после щелочной обработки происходит нарушение целостности молекул протеогликанов.