Виробництво бензилпеніциліну (стр. 2 из 5)
2. Стадії попередньої обробки культуральної рідини, клітин (міцелію) мікроорганізму й фільтрації (відділення культуральної рідини від біомаси продуцента). Ефективність стадії багато в чому визначається складом середовища для вирощування продуцента антибіотика, характером його росту, місцем основного нагромадження біологічно активної речовини (у культуральній рідини або всередині клітини).
3. Стадія виділення й очищення антибіотика. На цій стадії, залежно від властивостей антибіотика, його хімічної будови й основного місця нагромадження антибіотичної речовини, застосовують різні методи виділення й очищення. У якості основних методів використовуються екстракція, осадження, сорбція на йонообмінних матеріалах, розпарювання, сушіння.
Особливість цієї технологічної стадії визначається тим, що на першій стадії мають справу з невеликою концентрацією (~1 %) антибіотика в оброблюваному розчині, тоді як на наступних етапах його концентрація збільшується до 20-30 %. Усе це вимагає застосування різних місткостей і об'ємів використовуваних реагентів.
4. Стадії одержання готової продукції, виготовлення лікарських форм, розфасовки. Особливість стадії обумовлюється дуже високим вимогам до якості кінцевого продукту. У випадку випуску антибіотиків, призначених для ін'єкцій, препарати повинні бути стерильними; одержання таких антибіотичних препаратів, готування різних лікарських форм, дозування (розфасовка) і пакування повинні здійснюватися в асептичних умовах. Для максимального виходу антибіотика при культивуванні продуцента використовують комплекс заходів, що включають підбір найбільш сприятливих для цих цілей поживних середовищ, режимів культивування організму. Весь цей комплекс заходів включається в поняття «керований біосинтез».
У промислових умовах керований біосинтез вимагає суворого дотримання технологічного процесу як на стадії підготовки інокуляту, так і на стадії біосинтезу. На стадії підготовки інокуляту особливу увагу звертають на склад середовища, на якому вирощується організм, на вік клітин або міцелію. На стадії біосинтезу, крім складу середовища, велику роль відіграють швидкість споживання тих або інших компонентів, вміст попередників, регуляція процесу аерації культури, підтримка відповідних температури й рН середовища й інших показників режиму культивування.
У сучасних умовах виробництва вживають заходів для максимального зниження собівартості препаратів шляхом інтенсифікації всіх стадій технологічного процесу й, насамперед, підвищенням ефективності першої стадії – біосинтезу антибіотичної речовини.
Для цього необхідно:
а) впровадження у виробництво найбільш високопродуктивних штамів мікроорганізмів-продуцентів антибіотиків;
б) створення й забезпечення найсприятливіших умов розвитку продуцента антибіотика на відносно дешевих середовищах;
в) широке використання математичних методів планування процесу розвитку організму й електронно-обчислювальної техніки з метою оптимізації й моделювання умов його культивування, що забезпечують максимальний вихід антибіотика;
г) застосування сучасного обладнання на всіх стадіях технологічного процесу з автоматизованими системами, що контролюють основні параметри розвитку організму і стадій біосинтезу антибіотика.
Біотехнологічний процес одержання антибіотиків можна зобразити у вигляді наступної схеми (рис. 1) [2].
Рис. 1. Схема виробництва антибіотиків в процесі мікробіологічного синтезу.
3. Технологія біосинтезу бензилпеніциліну
3.1 Характеристика об’єкту біосинтезу
В 1871 р. В.А. Манасеїним було встановлено, що зелена цвіль Penicillium glaucum знищує бактерії, що потрапляють у культуральне середовище. Ця властивість Penicillium була тоді ж використана лікарем А. Г. Полотебневим, що використовував змочені цієї цвіллю пов'язки для лікування гнійних ран і виразок.
Видатне відкриття російських учених не одержало широкого розповсюдження, і в 1928 р. англієць Олександр Флемінг удруге виявив здатність цвілевого грибка Penicillium пригнічувати ріст мікроорганізмів. Було показано, що загибель мікробів обумовлена невідомою органічною речовиною, названою пеніциліном. Однак виділення пеніциліну в чистому вигляді в той же час не було здійснене, у зв’язку із його термолабільністю, і недосконалістю методів виділення та очищення.
У роки Другої Світової Війни величезна практична потреба в ефективних антибактеріальних препаратах привернула до пеніциліну увагу широкого кола фахівців, і приблизно з 1939 р. почався період інтенсивних досліджень. Завдяки цьому у відносно короткий термін (3 – 5 років) англійцями Х. Флорі й А. Четтеном (1940) були розроблені способи промислового одержання й очищення пеніциліну, вивчені його лікувальні властивості й методи клінічного застосування, а також встановлена його хімічна структура. До пеніцилінів відноситься група близьких по хімічних властивостях сполук, що містять у своїй структурі β-лактамне й тіазолідинове кільця: (див. рис. 2) [2].
Рис. 2. Структурна формула пеніциліну.
В пеніцилінах R може бути представлений різними структурами. Найбільш відомий і широко використовуваним є бензилпеніцилін, або пеніцилін G, в якому радикал представляє собою бензильний залишок (C6H6 – CH2 – ), в пеніциліні V радикалом є феноксиметил (C6H6 – О – CH2 – ) [3].
Спочатку його отримували методом поверхневого культивування. Технологія була досить примітивною – продуцент культивували в колбах або пляшках. Потреба в пеніцилі була дуже велика і об’єм його виробництва, хоч і в примітивних умовах, швидко збільшувався. Для культивування продуцента використовувались навіть пляшки з-під молока, оскільки були в наявності машини для їх миття та обробки. В кожну пляшку наливали поживне середовище шаром 1 – 4 см, що забезпечувало необхідні умови аерації. Пляши поміщали в спеціальні кошики, стерилізували, а потім охолоджували. Сухі спори або їх водну суспензію вносили в пляшки пульверизаторами або піпетками і ферментували протягом 5 – 10 діб за температури 24 °С.
На сьогоднішній день у всьому світі пеніцилін отримують так, як і решту антибіотиків, методом глибинного культивування [4].
Більшість пеніцилінів виготовляють у вигляді натрієвих або калієвих солей. Новокаїнові і бензатинові солі є основою пролонгованих препаратів пеніциліну для внутрішньо-м’язового введення.
В сухій кристалічній формі пеніцилінові солі досить стабільні протягом тривалого терміну за температури 4 °С.
На сьогоднішній день бензилпеніцилін необхідний не тільки як медичний препарат, але і як речовина, що є вихідним продуктом для отримання 6-АПК і в подальшому напівсинтетичних пеніцилінів. Із загальної кількості природних пеніцилінів приблизно 35 % використовуються як медичні препарати, а 65 % – для отримання 6-АПК [1].
3.2 Характеристика продуцента
В якості продуцента широко використовують культури Penicillium chrisogenum, види Penicillium утворюють спори (конідії).
До роду Penicillium входять гіфальні мікроорганізми із септованим міцелієм, що утворює конідіальні китиці на септованих конідієносцях. Конідії одноклітинні, круглі або овальні і переважно зеленого кольору (див. додаток 2).
Рід Penicillium нараховує близько 900 описаних видів, систематика яких значною мірою базується на особливостях формування китиць (одномутовчасті, двохмутовчасті, неправильні). Рід поділяється на підроди: Eupenicillium, Gliocladium, Scopulariopsis, Paecilomyces, Citromyces.
Penicillium chrysogenum належить до секції Asymmetrica, підсекції Asymmetrica-Velutina. Колонії на агаризованому середовищі плоскі, бархатисті. Розвинутий повітряний міцелій. З верхньої сторони колонії синьо-зелені, іноді з краплинами жовтого екссудату, з нижньої – безбарвні або жовтуваті. Конідії від еліптичних (3,3 × 4 мкм) до округлих (4 мкм), часто зібрані в тісні колонки. Конідієносці гладенькі [5].
В розвитку міцелію спостерігається ряд різних фаз. На початку і в середині розвитку міцелію у клітинах накопичуються жири. Згодом їх кількість зменшується, з’являються вакуолі з гранулами рибонуклеополіфосфатів, потім починається автоліз. Інтенсивний синтез пеніциліну починається за наявності великої кількості біомаси міцелію, за повного виснаження глюкози і молочної кислоти в середовищі і за рН, близького до нейтрального.
Під час вивчення пеніциліну встановлено, що серед продуктів його кислотного гідролізу завжди присутня β-диметилцистеїн. Введенням в поживне середовище речовин із міченими атомами C14, N15, S32 було вивчено механізм біосинтезу пеніциліну.
Прийнято вважати, що бензилпеніцилінова кислота синтезується із L-цистина, фенілоцтової кислоти і диметилпіровиноградної кислоти.
Для отримання пеніциліну спочатку розмножують спори. Їх можна вирощувати на агаризованих середовищах, в складі яких входить 0,5 % меляси, 0,5 % пептону, 0,4 % повареної солі, 0,01 % однозаміщеного фосфату калію і 0,005 % сульфату магнію. Спори вирощують за температури 25 – 27 °С протягом 4 – 5 діб.
В промисловості спори часто отримують, вирощуючи міцелій в скляних флаконах на просяному середовищі. Висушений споровий матеріал можна зберігати навіть за кімнатної температури.
Отриманий споровий матеріал використовують для засіву інокуляторів (1 – 3 флакони на апарат, де міцелій розмножують до кількості 5 – 10 % від об’єму посівних ферментерів) [4].
Промислові штами під час селекції дають невелику кількість варіантів, із яких відбирають найбільш активні і стабільні для подальшого використання. Культури зберігаються в ліофілізованому стані протягом 3 років. Пеніциліни також можуть синтезувати Penicillium notatum, P. brevicompactum, P. nigricans, P. turbatum, P. steckii, P. corylophylum, Aspergillus flavus, A. janus, A. nidulans [5].
3.3 Підготовка посівного матеріалу