Виробництво бензилпеніциліну (стр. 3 из 5)

Підготовка посівного матеріалу – одна з найвідповідальніших операцій у циклі біотехнологічного способу одержання антибіотиків. Від кількості і якості посівного матеріалу залежить як розвиток культури у ферментері, так і біосинтез антибіотика. Продуцент зазвичай вирощують на багатих по складу натуральних середовищах, здатних забезпечити найвищу фізіологічну активність мікроорганізмів. Підготовка посівного матеріалу – процес багатоступеневий (мал. 3).

Рис. 3. Схема багатоступеневого приготування посівного матеріалу А – вирощування у флаконах, Б – вирощування у колбах на качалках: 1 – законсервований вихідний матеріал; 2 – спорова генерація на скошеному агарі в пробірці; 3 – II спорова генерація на твердому середовищі; 3а і 3б – I і III генерації на рідкому середовищі в колбі; 4 – ферментер попереднього інокулювання; 5 – ферментер інокулювання; 6 – основний ферментер.

Мікроорганізм попередньо вирощують на агаризованому середовищі в пробірці (1, 2), потім із пробірки роблять висів у колби з рідким поживним середовищем, проводять дві генерації методом глибинного вирощування на качалках протягом двох-трьох діб для кожної генерації (3а й 3б). Із другої генерації культури в колбі роблять посів у невеликий (10 л) інокулятор 4, після чого добре розвинену культуру переносять у більший інокулятор 5 (100 – 500 л), звідки й роблять посів в основний ферментер 6. Для посіву в основний ферментер використовують від 5 до 10 % посівного матеріалу (інокуляту) [2].

3.4 Характеристика поживного середовища

Для промислового виробництва антибіотика використовують середовище, що містить кукурудзяний екстракт, гідрол, лактозу і мінеральні солі. Замість кукурудзяного екстракту можуть використовуватися арахісове борошно, вичавки, борошно із бавовняного насіння та інші джерела поживних речовин. Можливість широкого використання продуктів рослинного походження обумовлена тим, що продуцент має сильні протеолітичні ферменти. В якості вуглеводів часто використовують цукрозу або суміш лактози із глюкозою у співвідношенні 1:1. Глюкоза може знижувати біосинтез антибіотика; на середовищах, що містять лактозу або цукрозу (в умовах депресії), біосинтез антибіотика іде активніше. Важливу роль в процесі босинтезу пеніциліну відіграє сірка, що міститься в структурі антибіотику. В якості джерела сірки використовують сульфат або тіосульфат натрію. Надлишок йонів міді не впливає на ріст гриба, але пригнічує синтез пеніциліну. Ефект пригнічення біосинтезу знімається за рахунок додавання в середовище йонів заліза. Продуцент в якості джерела фосфору може використовувати не тільки фосфати, але й фітати (солі інозитфосфорних кислот): Penicillium chrisogenum містить фермент, що руйнує фітин з вивільненням неорганічного фосфору [1].

В посівних ферментерах міцелій вирощують 12 – 18 год, 12 – 15 % об’єму культуральної рідини використовують для початку основної ферментації. Поживне середовище для вирощування міцелію і біосинтезу пеніциліну готують зазвичай із кукурудзяного екстракту, лактози, глюкози, мінеральних речовин і декількох препаратів фенілоцтової кислоти – попередників антибіотиків [4].

Синтез того чи іншого пеніциліну залежить від наявності специфічної речовини в середовищі, інакше кажучи, попередника, якого мікроорганізм включає в молекулу антибіотика без попереднього розщеплення. Варто відзначити, що попередники біосинтезу пеніциліну (фенілоцтова кислота, фенілацетамід, феноксиоцтова кислота) за визначених концентрацій та значень рН середовища проявляють токсичну дію на продуцента. Фенілоцтова кислота найменш токсична. Додавання її в середовище в концентрації більше 500 мкг/мл пригнічує ріст міцелію, особливо в перші 24 год його розвитку. Фенілоцтова кислота додається в концентрації від 100 до 500мкг/мл через 24 год розвитку продуцента. За таких умов забезпечується найбільший вихід бензилпеніциліну, концентрацію якого через 72 год розвитку може досягнути 500 – 1000 мкг/мл.

Під час розвитку гриба без внесення попередника утворюється близько 45 % бензилпеніциліну (пеніцилін G) і близько 53 % пеніциліну К (радикал п-гептилпеніцилін). У разі додавання в поживне середовище фенілоцтової кислоти змінюється співвідношення утворюваних компонентів в бік різкого збільшення бензилпеніциліну, кількість якого залежно від віку досягає 75 – 95 % від суміші пеніцилінів. В процесі культивування Penicillium chrisogenum в середовищі, що не містить фенілоцтової кислоти, в ньому накопичуються сірковмісні сполуки не β-лактамної природи, наближені до цистеїну та метіоніну. Додавання в середовище фенілоцтової кислоти сприяє більш швидкому метаболізму сірковмісних компонентів та сполуки β-лактамної природи [1].

Склад деяких поживних середовищ, що використовуються у промисловості для основної ферментації пеніциліну, наведено у таблиці 1 [4].

Таблиця 1. Склад ферментаційних середовищ (в %) для отримання пеніциліну

Компонент	Середовище
	Кукурудзяне	Вичавкове	Жирове
Кукурудзяний екстрактГоріхові, соняшникові, соєві вичавкиЛактозаГлюкоза або гідролКашалотовий жир або рослинні оліїНітрат амоніюСульфат натріюДигідрофосфат каліюСульфат магніюТіосульфат натріюКарбонат кальцію (крейда)Попередники бензилпеніциліну	2,0 – 3,0–5,01,50,5 – 0,10,40,050,40,0250,20,5 – 0,10,3 – 0,4	–2,0 – 4,05,01,50,5 – 0,10,40,050,40,0250,20,5 – 0,10,3 – 0,4	2,0 – 3,0–1,01,52,5 – 3,50,40,050,40,0250,20,5 – 0,10,3 – 0,4

3.5 Стерилізація поживного середовища

Для кожного продуцента антибіотика розробляється оптимальне живильне середовище. Середовище повинне відповідати певним вимогам:

а) забезпечувати максимальний вихід антибіотика;

б) складатися з відносно дешевих компонентів;

в) мати гарну фільтруючу здатність;

г) забезпечувати застосування найбільш економічних прийомів виділення й очищення антибіотиків.

Стерилізація поживних середовищ у промислових умовах здійснюється двома методами: періодичним і безперервним.

Періодичний метод стерилізації застосовується у разі використання невеликих об'ємів середовища й полягає в тому, що середовище нагрівається до температури 120 – 130 °С безпосередньо у ферментерах або в спеціальних казанах-стерилізаторах, витримується при цій температурі протягом 30 – 60 хвилин (залежно від об'єму середовища і його складу), після чого охолоджується до 27 – 30 °С.

За час, затрачуваний на нагрівання середовища до температури, необхідної для стерилізації, і її охолодження, знищується значне число мікроорганізмів. Ефект стерилізації й збереження термолабільних речовин досягаються в тому випадку, якщо стерилізацію проводять за більш високої температури і за коротший проміжок час. Безперервний метод стерилізації доцільно застосовувати при використанні більших об'ємів середовища. Приготовлене середовище зі спеціальної посудини за допомогою насоса подається в стерилізаційну колону, через яку пропускають гостру пару (тиск пари близько 505 Па). Пару подають зверху по внутрішній трубі, що має щілиноподібні прорізи, завдяки чому він надходить у середовище, швидко її нагріваючи. Середовище в колону подається знизу й рухається по спіралі навколо внутрішньої труби.

Середовище, нагріте в колоні до необхідної для стерилізації температури (~130 °С), надходить у спеціальний апарат, де воно витримується певний час при температурі 125 – 130 °С. Час витримки залежить від складу середовища й триває 5 – 10 хвилин. Звідси стерильне середовище надходить у змієвиковий холодильник, охолоджується до 30 – 35 °С (на виході) і надходить у ферментер.

Безперервний метод стерилізації має ряд переваг: можливість автоматичного регулювання процесу, швидке й рівномірне нагрівання середовища, забезпечення більш повної стерильності середовища й ін.

У процесі підготовки поживного середовища для отримання бензилпеніциліну приготовлене середовище піддають стерилізації. Процес ведуть у колонах безперервної дії. Далі середовище надходить у витримувач, де охолоджується протягом певного часу до температури 23 – 25 °С [2].

3.6 Особливості перебігу процесу ферментації

У сучасних умовах найбільш перспективним методом вирощування мікроорганізмів-продуцентів антибіотиків визнаний метод глибинного культивування. Метод полягає в тому, що мікроорганізми розвиваються в товщі рідкого поживного середовища, через яке безупинно подається стерильне повітря, і за постійного перемішування.

Існує чотири основні модифікації глибинного способу вирощування мікроорганізмів:

1. Періодичне культивування. У цьому способі весь процес розвитку мікроорганізмів повністю завершується в одному ферментері, після чого ферментер звільняється від культуральної рідини, ретельно промивається, стерилізується й знову заповнюється свіжим поживним середовищем. Середовище засівається продуцентом, і процес відновляється.

2. Метод відбору. Культивування мікроорганізмів здійснюється у ферментерах з періодичним відбором частини об'єму культуральної рідини і доведенням свіжим поживним середовищем до попереднього рівня.

3. Батарейний спосіб. Мікроорганізми розвиваються в ряду послідовно з'єднаних ферментерів. Культуральна рідина на певній стадії розвитку мікроорганізму перекачується з першого ферментера в другий, потім із другого в третій і т.д. Звільнений ферментер відразу заповнюється свіжим поживним середовищем, засіяним продуцентом. У цьому способі вирощування мікроорганізмів місткості використовуються більш раціонально.

4. Безперервне культивування. В основі методу лежить принцип безперервного потоку поживного середовища, що дозволяє підтримувати розвиток мікроорганізму на певній стадії його росту. Стадія розвитку мікроорганізму визначається тим, що в цей період відбувається максимальний біосинтез антибіотика або іншої біологічно активної сполуки. Встановлено, що в умовах безперервного процесу біосинтезу деяких антибіотиків можна одержати чудові результати, якщо процес вести у дві стадії. У першому апараті батареї підтримують високу швидкість потоку, що забезпечує більшу швидкість росту продуцента антибіотика, для того, щоб одержати високоактивну біомасу, а в другому апараті – забезпечують низьку швидкість потоку й відповідно невелику швидкість росту. Процес безперервного культивування – перспективний напрямок сучасної біотехнології.