Перспективы применения липосомальных форм (стр. 4 из 14)

Специалисты ДГУ «Вектор-Фарм» ГНЦ ВБ «Вектор» в течение 10 лет разрабатывали и внедряли в медицинскую практику липосомальный генно-инженерный α-2b ИФН (торговое название в Украине – Липоферон) для перорального применения. В состав препарата Липоферон входят только фармацевтически приемлемые компоненты. Препарат выгодно отличается отсутствием в составе альбумина, способного вызывать аллергические реакции. Пероральное применение Липоферона надежно защищает организм больного от риска передачи инфекций (ВИЧ, вирусы гепатитов В, С (ВГВ, ВГС)) при инъекциях. Также отсутствует психоэмоциональный фактор, характерный для инъекций, особенно у детей. Готовая форма препарата представляет собой лиофильно высушенный продукт, восстанавливающий липосомальную структуру при добавлении воды.

В результате доклинического исследования было установлено, что ИФН, заключенный в липосомы, сохраняет биологическую активность в желудочно-кишечном тракте и всасывается в кровь. По скорости всасывания ИФН, заключенный в липосомы и применяемый перорально, оказался близок к свободному ИФН, вводимому внутримышечно, но в остальном фармакокинетика препаратов заметно отличалась. Так, например, высокий уровень накопления ИФН в сыворотке крови мышей регистрировался через 1 ч независимо от применяемой лекарственной формы препарата. Липосомальный ИФН отличался более длительным периодом циркуляции в крови лабораторных животных, его период полувыведения составлял 6 ч, в то время как у Реаферона-ЕС – 3 ч. К 6 ч уровень ИФН в сыворотке крови после введения Реаферона падал до фоновых значений, после введения Липоферона это происходило к 9 ч, с последующим новым подъемом к 15 ч.

2.4 Липосомы и противотуберкулезная терапия

Гидразид никотиновой кислоты — основной противотуберкулёзный препарат. Если упаковать его в липосомы, это позволит адресно доставлять лекарство к микобактериям туберкулёза. Исследованиями в этой области занимаются специалисты Научного центра клинической и экспериментальной медицины СО РАМН при поддержке федеральной целевой программы Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007—2012 годы.

При туберкулёзном воспалении образуются гранулемы, которые состоят из клеток иммунной системы макрофагов, набитых микобактериями туберкулёза. Поэтому в макрофаги необходимо доставить лекарство. Адресная доставка позволит снизить токсическую нагрузку на печень. Макрофаги обладают способностью заглатывать мелкие частицы, поэтому предлагаемое лекарство, гидразид никотиновой кислоты, упаковывают в липосомы. Новосибирские учёные создали молекулярно-липосомальные гибридные композиции (МЛГК) размером от 200 до 450 нм, которые содержат окисленные декстраны, связанные с лекарством. Теперь исследователи проверяют, какие факторы могут повлиять на эффективность заглатывания МЛГК фагоцитами.

Учёные провели эксперименты на мышиных макрофагах. Клетки обработали ферментами и соединениями, которые теоретически могли бы помешать макрофагам поглощать липосомы. Процесс поглощения можно условно разделить на две стадии: сначала МЛГК налипают на клетки, а потом попадают внутрь. Оказалось, что слущивание с поверхности фагоцитов белковых молекул, способных выполнять функции рецепторов, не играет роли в прилипании МЛГК к мембранам клеток. Несколько ослабить этот процесс может пониженный метаболизм в клеточных мембранах.

Собственно фагоцитоз, то есть доля клеток, поглощающих липосомы, и количество липосом, которые заглатывает одна клетка, зависит от подвижности цитоскелета клетки, то есть возможности мембраны втягиваться и выпячиваться, и от уровня метаболизма на клеточных мембранах. Нарушения этих процессов снижают активность фагоцитоза вдвое, но, тем не менее, поглощение МЛГК всё равно происходит. Исследователи пришли к выводу, что макрофаги активно захватывают лекарство, заключённое в липосомах, поэтому МЛГК в состоянии обеспечить его адресную доставку к микобактериям туберкулёза.

2.5 Использование липосом в химиотерапии при онкозаболеваниях

Стандартной экструзией через калиброванные ядерные мембраны получены стабильные липосомы среднего диаметра 100 нм на основе природных фосфолипидов и липофильных пролекарств широко применяемых химиотерапевтических средств – метотрексата и мелфалана. Липосомы показали эффективность при системном введении мышам с экспериментальными опухолями. Фармакокинетика метотрексата в плазме крови мышей свидетельствует о преимуществах его применения в виде липофильного пролекарства в липосомах.

Открытие явления пассивного транспорта частиц примерно 100-нм размеров в опухоли и очаги воспаления [1] послужило импульсом для бурного развития исследований в области разработки систем доставки лекарств. Применение нанотехнологий уже является общепризнанной в мире стратегией развития фармацевтического производства на ближайшие десятилетия. Включение лекарств в биосовместимые полимерные или супрамолекулярные носители уменьшает концентрацию свободных препаратов в кровотоке и препятствует их быстрому выведению почечной системой, что позволяет уменьшить общую токсичность и увеличить терапевтический индекс за счет улучшения фармакокинетики и биораспределения. Накопление наноразмерных носителей в опухолях и очагах воспаления осуществляется благодаря дефектной архитектуре формирующейся denovo сосудистой системы и повышенной проницаемости ее эндотелия. В то же время, высокое интерстициальное давление в солидных (твердых) опухолях не позволяет удерживаться в них частицам с размерами менее 30–40 нм (эффект enhanced permeability and retention). Оптимальный размер носителей, обеспечивающий пассивный транспорт лекарств, попадает в интервал 50–150 нм. Липосомы, наряду с липидными наносферами, относятся к наиболее био- и гемосовместимым носителям и пригодны для системного введения в организм. Липосомы более 30 лет назад привлекли внимание в качестве систем доставки лекарств. Исследования получили новый импульс после разработки технологии получения липосом Stealth® [2]. Поверхность таких липосом защищена от опсонизации (адсорбции белков плазмы) и преждевременного вывода из кровотока клетками иммунной системы благодаря экранированию привитыми высокогидратированными остатками полиэтиленгликоля. Препараты на основе Stealth-липосом применяются в клинике уже более 10 лет: например, липосомы с доксорубицином (Doxil, Caelix и др. производства США, стран ЕС, Украины) – для лечения саркомы Капоши и рака яичников [3]. Однако создание подобных конструкций для широкого спектра водорастворимых средств оказалось невозможным, поскольку метод активной загрузки, применяемый при их производстве, пригоден лишь для ограниченного числа лекарств, имеющих природу слабых амфифильных кислот или оснований (например, антибиотики антрациклинового ряда типа доксорубицина). Альтернативный лабораторный способ – формирование липосом в водно-солевом растворе лекарства с последующим отделением от невключившегося агента – нетехнологичен.

Мы предлагаем включать лекарства в липидный бислой липосом в виде липидных производных – липофильных пролекарств, которые расщепляются внутриклеточными ферментами с высвобождением исходного препарата. Такой подход упрощает технологию получения лекарственных липосом и делает ее универсальной. Более того, по сравнению с инкапсулированием в водный объем липосом, включение в бислой позволяет улучшить фармакологические свойства системы доставки в целом, благодаря уменьшению потерь лекарства как в кровотоке, так и при взаимодействии липосомы с клеткой. Очевидно также, что липидные производные способны к прямому трансмембранному переносу, что кардинально меняет механизм эндоцитоза и внутриклеточного трафика препарата и облегчает разгрузку липосом. Для сравнения, чтобы обеспечить выход лекарства из водного объема Stealth-липосом после их попадания в эндосомы клетки-мишени, предлагается использовать рН-чувствительные молекулярные триггеры, в том числе пептидные, фосфолипидные и др. Низкая эффективность внутриклеточной разгрузки, обусловленная жесткостью липидного бислоя (температура его фазового перехода превышает 60°С) и затрудненным слиянием с клеточными мембранами – один из существенных недостатков Stealth-липосом.

Нами разработаны синтезы липидных производных широко применяемых в клинике химиотерапевтических средств: мелфалана (и его рацемата сарколизина) и метотрексата [4, 5]. Цитотоксик мелфалан – алкилирующий агент, действующий независимо от стадии клеточного цикла, – применяется в химиотерапии почти 50 лет. Цитостатик метотрексат, антиметаболит фолиевой кислоты, также давно используется для лечения онкологических и аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит, где он по-прежнему остается «лекарством номер один». Связь между лекарством и остальной частью молекулы пролекарства должна легко гидролизоваться внутри клетки. Поскольку эстеразы обладают меньшей специфичностью, чем амидазы, и широко представлены во всех органах и тканях, предпочтительна сложноэфирная связь, а не амидная. Кроме того, при разработке молекулярных структур липидных конъюгатов учитывалось их наилучшее соответствие упаковке липидного бислоя липосом (рис. 1).

Рис. 3. Молекулярные структуры липидных конъюгатов лекарств и схематическое изображение лекарственной липосомы

Липосомы с пролекарствами формируются стандартным методом экструзии: липидные пленки, полученные из смеси всех амфифильных компонентов (яичный фосфатидилхолин, фосфатидилинозит из пекарских дрожжей и пролекарства), подвергаются гидратации буферным физраствором, затем 5-6 циклам замораживания (жидкий азот) – оттаивания и наконец, 10-20-кратной экструзии при температуре не выше +40°С через поликарбонатные мембранные фильтры с размерами пор 100 нм. Для экструзии мы используем установку фирмы Lipex (Канада) при давлении азота до 50 ат или ручной экструдер Avanti (США), в зависимости от количества требуемых препаратов. На рис. 2 приведены электронные микрофотографии дисперсий липосом, полученные методом замораживания-скалывания, который наиболее адекватно отражает размеры и структуру исходных липосом в водной фазе [6].