Выборку составили 304 индивида, средний возраст ±S.D. которых был 30,6±15,4, из них 99 женщин, средний возраст ±S.D. которых составил 26,3±14,6 года и 205 мужчин средний возраст ±S.D. – 32,8±15,4 лет. Диагноз туберкулеза легких устанавливался на основании данных микроскопии мокроты с обязательным рентгенологическим исследованием легких для определения формы заболевания и распространенности специфического процесса (общепринятые методы). Противотуберкулезную терапию больные получали по 1-ой категории, согласно рекомендациям ВОЗ (табл. 4).
Таблица 4
Режимы лечения больных с распространенным деструктивным туберкулезом легких по протоколам ВОЗ
| Масса тела до начала лечения, кг | Начальная фаза: 2 месяца | Фаза продолжения | |||
| 4 месяца | |||||
| Иониазид+ Рифампицин, таблетка 100мг+150мг 150мг+300мг | Пиразинамид, таблетка 500 мг | Этамбутол, таблетка 400мг | Стрептомицин, порошок для инъекций, 1г основания во флаконе | Иониазид+ Рифампицин, таблетка 100мг+150мг 150мг+300мг | |
| 33-50 | 3 табл. (100мг+150мг) ежедневно | 3 табл. ежедневно | 2 табл. ежедневно | 750 мг ежедневно | 3 таблетки ежедневно |
| 50 и более | 2 таблетки (150 мг+ 300мг) ежедневно | 4 табл. ежедневно | 3 табл. ежедневно | 1 г ежедневно | 4 таблетки ежедневно |
Семейная выборка больных туберкулезом легких.
Семейная выборка была зарегистрирована по пробандам – больным туберкулезом, находившихся на лечении в противотуберкулезных учреждениях г. Томска в период с 2000 по 2004 г.. Всего было обследовано 42 семьи (109 человек), в том числе 25, зарегистрированных по пробандам – детям в возрасте от 1 года до 15 лет (средний возраст ±S.D. составил 7,7±3,9). Семнадцать семей было выбрано по взрослым пробандам в возрасте от 17 до 48 лет (29,4±12,3 лет). В составе «пробанд/пробанды-мать-отец» исследовано 19 семей, в неполном составе, когда отсутствовал материал одного из родителей – 16 семей.
Группу пробандов – детей составили 10 мальчиков (7,2±2,9 лет) и 15 девочек (7,9±4,5 лет). Средний возраст пробандов – детей разного пола достоверно не различался (р>0,05). Среди взрослых пробандов было 7 женщин (19,8±7,9 лет) и 10 мужчин (23,9±9,1 лет). Всем пробандам был поставлен диагноз туберкулеза.
2.1.2. Характеристика группы больных атопической бронхиальной астмой
Исследованная семейная выборка была зарегистрирована по пробандам – больным БА, находившихся под наблюдением в клинико-профилактических учреждениях г. Томска в 1997-2000 г.. Клиническое обследование и диагностику провели сотрудники кафедры факультетской педиатрии с курсом детских болезней (заведующий – д.м.н., профессор Огородова Л.М.) Сибирского государственного медицинского университета, областного детского центра клинической иммунологии и аллергологии (Областная детская больница, г. Томск, главный врач – Сальников В.А.).
Семейная выборка больных БА.
Всего обследовано 76 семей (213 человек), 61 семья из которых была набрана в составе трех человек «пробанд-мать-отец» и 15 семей – в составе двух человек, т.е. «пробанд-мать/или отец». В исследуемой выборке были 72 индивида, зарегистрированные по пробандам-детям в возрасте от 1,7 до 15 лет (средний возраст ±S.D.составил 8,5±3,5). Восемь семей было выбрано по взрослым пробандам в возрасте от 24 до 42,5 лет (34,4±7,2 лет).
Основную часть пробандов-детей составили мальчики (n=47), девочек примерно в два раза меньше (n=25). Средний возраст пробандов-детей разного пола достоверно не различался (8,4±3,5 лет у мальчиков и 8,6±3,5 лет у девочек; р>0,05). Среди взрослых пробандов было семь женщин (34,4±7,2 лет). Всем пробандам был поставлен диагноз «атопическая бронхиальная астма».
Выборка больных БА.
Выборку больных БА составили 134 индивида (21,9±18,8 лет), из них 59 - женщины в возрасте от 2 до 79 лет (24,7±18,5 лет) и 75 – мужчины в возрасте от 1,7 до 68 лет (19,7±18,9 лет). Среди больных БА 78 индивидов – дети в возрасте от 1,7 до 15 лет (8,8±3,7 лет), из которых 28 девочек в возрасте от 2 до 15 лет (8,8±3,9 лет) и 50 мальчиков в возрасте от 1,7 до 14,8 лет (8,6±3,5 лет). Кроме того, среди индивидов общей выборки больных БА было 56 взрослых (40,3±15,6 лет), из которых 31 женщина в возрасте от 19 до 79 лет (39,0±13,9 лет) и 25 мужчин от 19 до 68 лет (41,9±17,5 лет). Между группами мальчиков и девочек, а также мужчин и женщин не показано различий по возрастному критерию (р>0,05). Всем пациентам был выставлен диагноз «атопическая бронхиальная астма».
2.2. Характеристика методов исследования
2.2.1. Клинико-лабораторные методы
Пробанды, а также их родственники первой степени родства, согласившиеся на проведение исследования, были обследованы для верификации диагноза БА и симптомов атопии. Обследование включало сбор семейного анамнеза и многочисленные клинические тесты: в данной работе были использованы результаты только спирометрических, аллергологических и иммунологических анализов.
Диагноз «бронхиальная астма» верифицировали на основании критериев ВОЗ: наличие характерного для заболевания анамнеза, типичных клинических симптомов астмы, атопии (атопический анамнез, положительные скарификационные аллергопробы (САП), уровень общего сывороточного IgE более 100 МЕ/мл) [Бронхиальная астма. Глобальная стратегия, 1996]. В случае невозможности доказать наличие атопии, выставляли диагноз неатопической БА. Степень тяжести заболевания устанавливали согласно критериям проекта GINA (2002 г.) и Национальной программы лечения и профилактики БА у детей (1997 г.).
Аллергологическое обследование включало сбор аллергоанамнеза и проведение САП на пищевые, ингаляционные, эпидермальные, растительные и грибковые аллергены с использованием стандартных наборов согласно рекомендациям производителей («Биомед», Москва; «Immuno Tek», Испания).
Измерение уровня общих сывороточных антител класса E проводили с помощью твердофазного иммуноферментного анализа с использованием стандартных наборов согласно рекомендациям производителей («Протеиновый контур», Санкт-Петербург; «Veda Lab», Франция). Уровень общего сывороточного IgE пересчитывали на международные единицы на миллилитр (МЕ/мл; 1 МЕ =2,42 нг/мл).
Исследование функции внешнего дыхания (ФВД) осуществляли по стандартной методике (анализ кривой «поток-объем» и показателей спирометрии) на установке «Master Lab Pro» («Эрих Йегер», Германия) [Quanjer et al. 1993].
Для определения степени реактивности бронхов проводили провокационный тест с метахолином. Диапазон концентраций растворов метахолина составили 0,25-32 или 64 мг/мл. Результаты выражали как концентрация метахолина, вызывающая не менее чем 20% падение объема форсированного выдоха (РС20), вычисленная методом линейной интерполяции по общепринятой формуле [Sterk et al., 1993]. Диагностически значимой в отношении БА считали РС20 не менее 20 мг/мл – это состояние рассматривали как наличие бронхиальной гиперреактивности (BHR).
В отношении больных ТБ был проведен полный клинико – эпидемиологический анализ с учетом возраста начала заболевания, социального статуса, вредных привычек (курение, злоупотребление алкоголем, употребление наркотиков), сопутствующей патологией, наличия контакта с туберкулезным больным, а также данные о ТБ в роду. Анализу подвергались выраженность клинических проявлений (жалобы, объективный статус больного), результаты лабораторных и инструментальных методов исследования (микроскопия и посев мокроты на МБТ, чувствительность к противотуберкулезным препаратам, рентгенологическое исследование легких) на момент начала заболевания, а также через 2 месяца лечения.
Определение количества эритроцитов, концентрации гемоглобина, общего числа лейкоцитов и их отдельных морфологических форм, величину СОЭ, уровень печеночных проб (билирубина, аланинаминотрансферазы и аспартатаминтрансферазы) исследовали общепринятыми методами [Меньшиков, 1987].
2.2.2. Молекулярно-генетические методы
В ходе выполнения работы было исследовано 6 полиморфных вариантов генов цитохромов Р450 (CYP2C19, CYP2E1) и глутатионовых S-трансфераз (GSTT1, GSTM1 и GSTP1) (табл. 4).
Для генотипирования индивидов по указанным полиморфизмам использовали образцы тотальной ДНК из банка НИИ медицинской генетики (семейная выборка больных БА и контрольная выборка) и ДНК, выделенную из цельной венозной крови (семейная выборка больных ТБ) по стандартной неэнзиматической методике [Маниатис и др., 1984; Lahiri et al., 1992]. Выделенную ДНК замораживали и хранили при температуре -20°С до проведения эксперимента.
Генотипирование осуществляли с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), используя структуру праймеров и параметры температурных циклов, описанных в литературе (табл. 5). Смесь для ПЦР содержала 0,5-2,0 мкл специфической пары праймеров с концентрацией 1 о.е./мл, 1,2-1,8 мкл 10´ буфера для амплификации с концентрацией MgCl2 0,5-2,0 mM, 0,5-1,0 е.а. Taq ДНК-полимеразы («Сибэнзим», «Медиген», Новосибирск) и 100-200 нг геномной ДНК. Смесь помещали в 0,5 мл пробирки типа «Эппендорф», наслаивали сверху минеральное масло для предотвращения испарения и амплифицировали в автоматических минициклерах «MJ Rеsearch» (США) и «ЦиклоТемп 105» (Россия-Австрия).
Программа амплификации включала предварительную денатурацию при 94°С в течение 5 минут, с последующими 30-35 циклами отжига при температуре 60°С (1мин.), элонгации цепи при 72°С (40 сек.) и денатурации при 94°С (40 сек.). Программу завершала финальная элонгация при 72°С в течение 3 минут. Амплификат подвергали гидролизу соответствующей рестриктазой (табл.4) при оптимальной для фермента температуре на протяжении 12-24 ч. Рестрикционная смесь включала 5-7 мкл амплификата, 1,0-1,2 мкл 10´ буфера для рестрикции, поставляемого фирмой – производителем («Сибэнзим», Новосибирск), и 1-5 единиц активности фермента (в зависимости от эффективности его работы). Продукты рестрикции фракционировали 20-30 минут в 3% агарозном геле при напряжении 120 В. Фрагменты ДНК окрашивали бромистым этидием и визуализировали в ультрафиолетовом свете с применением компьютерной видеосъемки на приборе «UV-VIS Imager-II» (США).