0,2 мл экстракта наносили на полоску хроматографической бумаги размером 45´15 см и хроматографировали в системе 0,1 М хлороводородной кислоты. Хроматограмму высушивали, в УФ-свете отмечали пятна флавоноидов, вырезали и элюировали 96% этанолом три раза по 10, 5 и 5 мл в колбе спритертой пробкой с обратным холодильником на водяной бане. Полученное извлечение флавоноидов сливали в мерную колбу на 25 мл, доводили до метки 96% этанолом и снимали оптическую плотность элюятов с помощью спектрофотометра с толщиной слоя 1 см при длине волны 353нм.
Сумму флавоноидов пересчитывали на кверцетин (Е =387,5) поформуле:
C= Д*У1*К*У2*100/(Е *I*М*(100-В)*У3,где
Д- оптическая плотность
У1- объем первого извлечения, мл (50 мл)
У2- объем второго извлечения, мл (25мл)
У3- объем, пошедший на хроматографирование, мл (0,2 мл)
Е -удельный показатель поглощения
М- масса навески, г
В- влажность сырья, %
I- толщина слоя, см
К-поправочный коэффициент на неполное элюирование с бумаги (1,15)
7. Количественное определение соединений кремния
В предварительно прокаленный фарфоровый тигльпомещали около 1,0 г сырья, сжигали и прокаливали в муфельной печи при температуре не выше 560-650 °С до постоянной массы (3-5 часов).
После охлаждения золу количественно переносили в стакан емкостью 150 мл, добавляли 50 мл 5% раствора хлороводородной кислоты и нагревали на кипящей водяной бане в течение 20 мин. Полученный раствор отфильтровывали через рыхлый беззольный фильтр, осадок промывали 1% раствором хлороводородной кислоты.
Фильтр с осадком переносили в коническую колбу на 150 мл, добавляли 50 мл 5% раствора гидроксида калия, затем прикрыв часовым стеклом, нагревали до кипения и кмпятили в течение 20 мин (колбу перед нагреванием взвесили). После охлаждения содержимое колбы доводили до первоначальной массы 5% раствором гидроксида калия.
1 мл полученного фильтрата помещали в мерную колбу на 25 мл, прибавляли 2 мл 5% раствора серной кислоты, доводили водой до метки. Через 15 мин определяли оптическую плотность с помощью фотоэлектроколориметра в кювете с толщиной слоя 10 мм при длине волны 400 нм, используя в качестве раствора сравнеия фильтрат без добавления реактивов.
8. Методика определения экстрактивных веществ.
20 г сырья измельчали и просеивали сквозь сито с отверстиями диаметром 1мм, помещали в коническую колбу прилив растворителя до «зеркала». Колбу закрывали пробкой, взвешивали и оставляли на 16 часов. Затем содержимое тщательно взбалтывали и фильтровали через сухой фильтр в сухую колбу. Фильтрат переносили в фарфоровую чашку диаметром 7-9 см, предварительно высушенную при t° +100°C до постоянной массы и взвешенную на аналитических весах. Фильтрат выпаривают на водяной бане досуха, и сушат при t° 100-105°С в течении 3 часов, охлаждали в эксикаторе и взвешивали.
9. Определение микроэлементного состава.
Для определения минерального состава травы хвоща использовался рентгено-флуоресцентный метод.
В чашку (тигль) берут навеску измельченного продукта (пробы взвешивают с погрешностью не более + 0,01 г), помещают в сушильный шкаф и высушивают при температуре около +105°С.
Содержимое чаши смачивают 2-3 мл 32% раствором азотной кислоты и нагревают на водяной бане до прекращения выделения паров. Обработку азотной кислотой повторяют еще дважды. Затем чашу помещают на электроплитку и проводят обугливание до прекращения выделения дыма, потом чашу переносят в электропечь при температуре около +250°С. Минерализацию проводят, постепенно повышая температуру электропечи на +50°С через каждые 30 мин и, доведя ее до температуры +450°С, продолжают минерализацию при этих условиях до получения золы. Чашу с золой извлекают из электропечи, охлаждают до комнатной температуры и смачивают золу 0,5-1,0 мл 32% раствором азотной кислоты. Затем кислоту досуха выпаривают на электроплитке со слабым нагревом и снова помещают чашу с пробой в электропечь при температуре, постепенно доводя температуру до 450°С и выдерживают 1 час. Минерализацию считают законченной, когда зола станет белого или слегка окрашенного цвета, без обугленных частиц. При наличии обугленных частиц повторяют обработку золы раствором азотной кислоты или водой.
В чашу с золой добавляют 10 мл 32% раствора азотной кислоты, нагревают на электроплитке со слабым нагревом до появления запахов азота. Содержимое чаши фильтруют в стакан через фильтр «белая лента». Тщательно ополаскивают чашу водой очищенной, фильтруя смыв чаши в тот же стакан. В фильтрат, содержащий тяжелые металлы добавляют азотнокислый цирконил, нагревают, фильтруют. Полученный осадок анализируют на приборе спектрометре «Спектроскан».
10. Исследование антигрибковой активности
С целью изучения антигрибковых свойств БАВ хвоща полевого воздушно-сухое сырье измельчали до размера частиц 2-5 мм, заливали до «зеркала» экстрагентом (вода очищенная, этиловый спирт 70%, бутанол, хлороформ, эфир) настаивали в течении 16 часов, фильтровали и полученные экстракты высушивали в струе воздуха, нагретого до +30°С.
Антигрибковые свойства полученных экстрактов исследовали методом двукратных серийных разведений в жидкой среде Сабуро по методике Вичкановой С.А.. Состав среды Сабуро:
- 10,0 пептона,
- 40,0 мальтозы,
- воды очищенной до 1 л.
В качестве тест-культуры использовали штаммы Aspergillus niger 163/3685, Candida albicans 4337, Trichophiton rubrum ВКПГ248/700, T. Mentagrophytes var. Interdigitale ВКПГ 268, Microsporum canis ВКПГ 326/316, которые были получены в отделе микологии центрального кожно-венерологического института Министерства здравоохранения России г. Москва.
Подготовка грибов-дерматофитов к опыту, посев и их учет проводили по методу Г.Н. Першина. Для посева использовали суспензии как правило, суточной агаровой культуры дрожжей, культуры плесневого гриба 4-5 суточные, остальных дерматофитов 7-10 суточные. Взвеси грибов готовили в физиологическом растворе по оптическому стандарту мутности.
После дополнительных разведений стандартного раствора микробная нагрузка патогенных грибов составляла 1000 грибковых тел в 1 мл среды. Посевы инкубировали в термостате, дрожжи при 37°С, остальные при 33°С.
Учет культуры дрожжей проводили через 24 часа, другие культуры на 7-10 сутки. Предельная доза препарата испытанная нами, соответствовала 1000 мкг/мл. Повторность каждого опыта 4-6 кратная. Контролем служили пробирки с питательной средой, засеянные аналогичным количество тест-культуры, а также пробирки со средой и препараты без культуры (для проверки мутности и осаждения препарата).
За критерий антигрибковой активности препарата принимали фунгистатический титр, который оценивали в микрограммах на 1 мл (мкг/мл) питательной среды. За фунгистатический титр принимали предельную концентрацию препарата в среде, при которой отсутствовал видимый рост культуры в условиях оптимальной темпиратуры и заданной микробной нагрузки.
Глава III Перспективность использования рода хвоща для получения лекарственных препаратов
3.1 Перспективность использования рода хвоща для получения лекарственных препаратов.
Как в нашей стране так и за рубежом известно мочегонное действие хвоща полевого. Нами было проведено изучение различных литературных данных и в некоторых из них встречается информация о возможности использования хвоща полевого в косметологии и дерматологии. В таблице 1 представлены результаты исследования, в которой в сравнении с хвощем полевым приведены еще 43 вида лекарственных растений произрастающих на территории Сибири и использующихся в косметологии и дерматологии.
| Лекарственные растения | косм-е ср-во | дермат. аллергии | псориаз/ экзема | антимикр ср.-во |
| 1. Анис обыкновенный | /+ | |||
| 2. Береза бородавчатая | + | + | ||
| 3. Бузина черная | + | + | /+ | |
| 4. Василек синий | + | |||
| 5. Верба белая | + | |||
| 6. Вероника лекарственная | + | /+ | ||
| 7. Горечавка крестовидная | + | +/ | + | |
| 8. Донник лекарственный | + | + | ||
| 9. Душица обыкновенная | + | + | ||
| 10. Зверобой продырявленн. | + | + | /+ | |
| 11. Земляника лесная | + | |||
| 12. Календула лекарственная | + | + | ||
| 13. Калина обыкновенная | + | +/+ | + | |
| 14. Крушина ломкая | + | + | + | |
| 15. Картофель | + | + | ||
| 16. Клубника дикая | + | |||
| 17. Крапива обыкновенная | + | + | ||
| 18. Лопух большой | + | +/+ | + | |
| 19. Лук репчатый | + | + | + | |
| 20. Малина обыкновенная | + | + | + | |
| 21. Морковь обыкновенная | + | /+ | + | |
| 22. Медуница лекарственная | + | + | +/+ | |
| 23. Мелисса лекарственная | + | + | + | |
| 24. Можжевельник обыкн. | + | + | + | |
| 25. Мята перечная | + | + | ||
| 26. Облепиха крушиновидная | + | + | +/ | + |
| 27. Овес полевой | + | |||
| 28. Одуванчик лекарств-й | + | + | + | |
| 29. Петрушка огородная | + | + | +/+ | |
| 30. Подорожник большой | + | + | + | |
| 31. Полынь горькая | + | + | + | |
| 32. Родиола розовая | + | + | +/ | |
| 33. Шиповник коричный | + | + | ||
| 34. Ромашка аптечная | + | |||
| 35. Ряска малая | + | +/ | + | |
| 36. Сосна обыкновенная | + | + | ||
| 37. Тысячелистник обыкн. | + | + | ||
| 38. Чемерица Лобеля | + | + | ||
| 39. Череда трехраздельная | + | + | +/ | + |
| 40. Фиалка трехцветная | + | + | /+ | |
| 41. Чабрец обыкновенный | + | + | ||
| 42. Чистотел большой | + | +/ | + | |
| 43. Шалфей лекарственный | + | + | + | |
| 44. Хвощ полевой | + | + | +/+ | + |
Из перечисленных 44 видов лекарственных растений 43 вида используются в косметологии. Применение в дерматологии изучалось по следующей активности: антимикробное средство, псориаз, экзема, аллергодерматозы.