У павшего животного при подозрении сибирской язвы также берут пробу крови. Если количества крови недостаточно, то проводят следующие манипуляции. Ухо со стороны, на которой лежал труп, перевязывают шпагатом в двух местах, ближе к основанию и отсекают между перевязкой. Места разреза прижигают калёным железом. Затем отрезанное ухо помещают в герметичный пакет и в термос. Вскрытие трупа недопустимо ! Если вскрытие сделано, то с предосторожностью отбирают лимфатические узлы, кусочки селезёнки и печени, помещают в двойные герметичные полиэтиленовые пакеты и в термос. От свиней пробы крови не берут. В качестве патологического материала используют кусочки воспалённой ткани в области отёка и заглоточные лимфатические узлы.
Для исследования кожевенного сырья от каждой кожи отрезают участок величиной 3х3 см и надевают на бечёвку, маркируют и обеззараживают в камере Крупина при 0,7 атм. в течение 1 часа 45 минут.
5.2. Лабораторные исследования
В ветеринарных лабораториях в зависимости от их оснащения могут быть проведены следующие исследования: микроскопия мазков, бактериологические исследования с целью выделения чистой культуры и изучения их свойств, идентификация выделенной культуры, биопроба на лабораторных животных, серологические исследования.
5.2.1. Микроскопические исследования. Из доставленного патологического материала делают мазки, фиксируют этиловым спиртом с добавлением 3% перекиси водорода, окрашивают по Граму и на капсулу - по Михину, Ребигеру, Ольту или Романовскому-Гимза; при наличии люминесцентных сывороток используют метод флюоресцирующих антител.
В масках, окрашенных по Граму, Bac. anthracis - грамположительная палочка (прямая). Палочки располагаются короткими цепочками или попарно, концы их, обращенные друг к другу, резко обрублены, свободные концы обычно закруглены. В отдельных случаях (чаще в мазках от свиней) форма микробов сибирской язвы может быть нехарактерной (короткие толстые или изогнутые, иногда зернистые палочки со вздутием посередине или на конце, возможно наличие "теней" микробов).
В окрашенных специальными методами мазках из патологического материала и среды ГКИ сибиреязвенные палочки окружены капсулой.
В фиксированных препаратах капсулы бацилл хорошо окрашиваются всеми способами: Михина, Ребигера, Ольта, Романовского-Гимзы, Бурцева, Ионе, Кауфмана.
Окраска по Михину. Мазок окрашивают леффлеровской метиленовой синью в течение 2-3 минут, при этом его подогревают до появления паров. Краску быстро смывают водой, а мазок высушивают фильтровальной бумагой. Бациллы - тёмно-синие, капсулы- светло-розовые.
Окраска по Ребигеру. 15-20 г генцианвиолета растворяют в 100-150 мл 40% формалина, тщательно и многократно взбалтывают и дают отстоятся несколько часов, затем фильтруют. Полученным раствором окрашивают нефиксированные мазки. Бациллы -тёмно-фиолетовые, капсулы фиолетово-розового цвета.
Окраска по Ольту. В 100 мл кипящей дистиллированной воды растворяют 3 г сафранина, после охлаждения фильтруют. Красят 1-2 мин. Бациллы - красные, капсулы - жёлтые.
Окраска по Романовскому-Гимзе. На фиксированный мазок наносят краску, выдерживают в течение 15-20 минут и быстро смывают. Бациллы тёмно-синие, капсула розовая или бледно-розовая.
По результатам микроскопического исследования немедленно дают предварительный ответ. В случае обнаружения капсульных форм бацилл диагноз на сибирскую язву считают установленным и дальнейшие исследования продолжают в соответствии с инструкцией.
5.2.2. Посев на питательные среды. Посевы из исходного патологического материала делают в МПБ и на МПА или в бульон и на агар Хоттингера (рН 7,4). Одновременно можно делать посевы на дифференциально-диагностическую среду с 0,01 % фенолфталеинфосфата натрия, а также на желатин, кровяной бульон и агар, среду ГКИ (60 % стерильного раствора Хенкса без антибиотиков и 40 % стерильной неконсервированной сыворотки крупного рогатого скота, инактивированной при 56-580С в течении 30 мин, рН 7,2-7,4).
Посевы инкубируют 18-24 ч при температуре 37-38 (С и при отсутствии роста выдерживают при той же температуре еще 48 часов.
После суточного роста сибиреязвенных бацилл МПБ остается прозрачным, а на дне образуется рыхлый, в виде комка ваты осадок, разбивающийся при встряхивании. Из бульонной культуры делают мазки, окашивают по Граму и микроскопируют. В мазках обнаруживают цепочки, состоящие из сибиреязвенных палочек или парно расположенные палочки. На плотных питательных средах бациллы сибирской язвы образуют плоские матово-шероховатые колонии. Под малым увеличением микроскопа колонии имеют вид сплетённых нитей («голова медузы»). При посеве уколом в столбик 10-12% желатины бациллы на 2-5 сутки образуют желтовато-белый стержень.
5.2.3.Биологическая проба. Исследуемый патологический материал (в день поступления) суспендируют в небольшом объеме 0,9%-ного раствора натрия хлорида, вводят двум белым мышам в дозе 0,2-0,5 мл под кожу спины ближе к корню хвоста или 0,5-1 мл двум морским свинкам подкожно в области живота. Гибель животных наступает через 1-3 сут, иногда позже.
5.2.4. Окраска сибиреязвенных спор. Для этой цели используют методы: Ауески, Златогорова, Дорнера, Пешкова, Мюллера, Трухильо, Клейна, Шеффера, Фултона и др. Лучше окрашиваются споры методом Ауески и особенно Трухильо.
5.2.5. Реакция преципитации по Асколи.
Реакцию ставят в уленгутовской пробирке. Для этого в уленгутовскую пробирку вносят 0,2-0,3 мл прозрачной преципитирующей сибиреязвенной сыворотки и затем осторожно наносят равное количество экстракта проб специально подготовленного (горячий или холодный способ) патологического материала. При положительной реакции через 10-12 минут на границе соединения компонентов обнаруживают характерный серовато-белый диск (преципитирующее кольцо).
5.2.6. Идентификация возбудителя сибирской язвы.
Применительно к возбудителю сибирской язвы имеется большая группа микробов-сапрофитов, близкородственных Bac.anthracis по основным культурально-морфологическим и биохимическим свойствам (Bac. anthracoides, Bac.pseudoanthracis, Bac. cereus, Bac. mesentericus, Bac.megaterium, Bac. subtilis, Bac. mycoides).
Идентификацию проводят по следующим признакам: морфология микроба, включая наличие капсул в мазках из исходного патологического материала или органов павших подопытных животных (сапрофиты капсул не имеют); культуральные свойства; патогенность для лабораторных животных (гибель хотя бы одного из двух лабораторных животных, зараженных суспензией из исходного патологического материала или полученной культурой возбудителя, с последующим выделением ее из органов мыши или морской свинки. Сапрофиты непатогенны для морских свинок и кроликов)
При наличии в мазках характерных морфологических и культуральных свойств и капсул из исходного патологического материала дальнейшее изучение культуры не проводят. В случае получения нечетких результатов по одному из первых двух свойств, не дожидаясь результатов биопробы, определяют чувствительность культуры к сибиреязвенным бактериофагам и пенициллину.
Проба бактериофагом основана на использовании сибиреязвенных бактериофагов (вирусов сибиреязвенных бацилл), которые при взаимодействии с сибиреязвеной культурой вызывают её разрушение (лизис). Сибиреязвенные бактериофаги не лизируют сапрофитные бациллы. Реакция высокоспецифична и применяют её для идентификации возбудителя сибирской язвы и дифференциации его сапрофитных бацилл.
Тест "жемчужного ожерелья.
Сибиреязвенные бациллы при посева на мясо-пептонный агар с пенициллином имеют вид жемчужного ожерелья. Спорообразующие сапрофитные аэробные микробы в аналогичных условиях вырастают в виде обычных форм.
Выделенную культуру относят к Bac. anthracis при наличии капсул в мазках из исходного патологического материала или органов павшего зараженного животного и других характерных морфологических и культуральных свойств возбудителя: при отсутствии капсул, но наличии других характерных морфологических и культуральных свойств возбудителя, чувствительность его к сибиреязвенному фагу и пенициллину.
5.2.7. Постановка диагноза.
Диагноз на сибирскую язву у животного считают установленным в одном из следующих случаев:
- обнаружение капсульных форм Bac. anthracis в патологическом материале;
- гибель хотя бы одного лабораторного животного из двух, зараженных суспезией из исходного патологического материала, с последующим выделением из его органов культуры Bac. anthracis даже при отсутствии роста культуры возбудителя из патологического материала;