Биохимические показатели крови человека при сальмонеллезной интоксикации (стр. 3 из 8)
Пристальное внимание исследователей к МСМ объясняется высокой биологической активностью их отдельных фракций, которые ингибируют гликолиз, глюконеогенез, пентозный цикл, синтез гемоглабина, нуклеиновых кислот, мембранный транспорт, дагоцитов, эритропоэз, микроциркуляцию, обладают иммунодепрессивным, цитотоксическим, нейро- и психотропным свойствами. Сейчас, квалификационная оценка степени тяжести состояния больных при сальмонеллезе немыслима без определения МСМ [40].
Установлено, что значительная часть циркулирующих в крови СМ не только растворена в плазме крови, но и связана с альбумином.
Человеческий сывороточный альбулин (ЧСА) – важнейший транспортный белок, осуществляющий перенос эндогенных метаболитов и ксенобиотиков в плазме крови, межклеточной жидкости, в лимфе.
Универсальность транспортной функции ЧСА обеспечивается его уникальной способностью связывать лиганды различной химической природы. Интенсивная лигандная нагрузка молекул альбулина приводит к изменению их структуры и связывающей способности. Такие модификационные формы ЧСА обнаруживаются при патологии [41].
О величине токсического действия вредных веществ можно судить по ЭКА, которая снижается после того, как токсические вещества займут центры связывания в молекуле альбулина, что приводит к снижению детоксикационных свойств организма. Изучение свойств альбулина является важным с точки зрения как диагностики, так и лечения [42].
2. Материалы и методы исследований
2.1. Материал исследований
Уровень интоксикации оценивался по изменениям в крови больных эффективной и общей концентраций сывороточного альбулина, малонового диальдегида, как одного из продуктов ПОЛ, уровня холестерина, ЦИК, МСМ и активности каталазы.
Для всех исследований бралась сыворотка крови. Исследовано 30 больных сальмонеллезом в возрасте от 17 до 46 лет. Для контроля набиралась группа 51 человека разного пола в возрасте от 20 до 46 лет.
Кровь бралась из локтевой вены, преимущественно натощак в количестве не менее 5 мл. Центрифугируем 1500 об/мин 10 минут. Для выполнения анализов сыворотки необходимо использовать сразу или заморозить и хранить при t=-20
С.2.2. Методы исследований
2.2.1. Определение МДА с тиобарбитуровой кислотой
(Конюхова В.С., 1989)
Об изменении интенсивности ПОЛ судим по изменению уровня вторичного продукта ПОЛ – малонового диальдегида.
Метод основан на том, что при высокой температуре в кислой среде МДА реагирует с 2-ТБК, образуя окрашенный розовый триметиновый комплекс с максимумом поглощения при 535 им.
Ход работы: К 0,2 мл сыворотки крови добавить 0,2 мл дистиллированной воды, 1 мл 0,6 % ТБК в ледяной уксусной кислоте. Кипятить 30 минут, охладить и добавить 1 мл 5№ КОН и 2 мл изопропанола. Центрифугируют при 6000 об/мин 20 минут. Колориметрируют при 535 нм и 580 нм против контроля, содержащего вместо плазмы воду.
Расчет:
(мкМоль/л), где Е – оптическое поглащение изопропилового экстракта; 106 – коэффициент пересчета оптической плотности.Пример расчета: больной Максимов С., 19 лет
концентрация МДА =
(мкМоль/л).2.2.2. Определение активности каталазы
(Королюк М.А., 1988)
Метод основан на способности перекиси водорода образовывать с солями молибдена стойкий окрашенный комплекс.
Ход определения: Реакция запускается добавлением 0,1 мл сыворотки крови к 2 мл 0,03 % раствора перекиси водорода. В холостую пробу вместо сыворотки вносят 0,1 мл дистиллированной воды. Реакцию останавливают через 10 минут добавлением 1 мл 4% молибдата аммония. Интенсивность окраски измеряют на спектрофотометре при длине волны 410 нм против контрольной пробы, в которой вместо перекиси водорода вносят 2 мл воды.
Расчет:
(мкат/л), гдеЕ – активность каталазы в мкат/л;
А – оптическая плотность холостой и опытной проб;
V – объем вносимой пробы, 0,1 мл;
t – время инкубации, 600 сек;
К – коэффициент миллимолярной экстинкции перекиси водорода, равный
.За единицу активности каталазы принимают то количество фермента, которое участвует в превращении 1 мкат перекиси водорода за 1 секунду при заданных условиях. Расчет активности каталазы ведут на 1 л сыворотки крови.
Пример расчета: больной Крайнов Т.В., 31 год.
(мкат/л)2.2.3. Определение общего холестерина в сыворотке крови ферментативным методом «Фотокол»
(Творогова М.Г., 1995)
Определение основано на сопряженных реакциях, которые катализирует холестеринэстераза, холесериноксидаза и пероксидаза:
Эфиры холестерина
холестерин + Ж.К.;Холестерин + О2
холестинон + Н2О2;Н2О2 + хромогены
Н2О + окрашенный продукт.Концентрация образующегося в ходе реакции окрашенного продукта пропорциональна концентрации холестерина в пробе.
Ход определения: Рабочий реагент обязательно вносить в пробирки после проб, содержащих холестерин. Пробирки встряхнуть и инкубировать при t = 37oС. Через 10 минут после начала инкубации пробирки повторно встряхнуть и инкубировать 20 минут при t = 37oС. Окрашенные пробы фотометрировать при 500 нм в кювете с длиной оптического пути 5 мм или 10 мм относительно холостой пробы. Окраска стабильна в течении двух часов при комнатной температуре.
Концентрацию холестерина в исследуемых пробах рассчитать по формуле:
ммоль/л, гдеЕОП и ЕК – оптические плотности исследуемой пробы и пробы с калибратором.
Норма: 3,62 – 5,2 ммоль/л.
2.2.4. Определение циркулирующих иммунных комплексов
в крови методом ПЭГ-теста (Гриневич Ю.А., 1988)
Метод основан на селективной преципитации комплексов АТ-АГ в 3,75 % ПЭГ (полиэтиленгликоля) с последующим определением плотности преципитата.
Реактивы:
1) 0,1 м боратный буфер (3,410 г борной кислоты, 4,275 г буры растворить в 1 л дистиллированной воды)
2) 10 г полиэтиленгликоль – 6000 ед. растворить в 240 мл буфера.
Ход определения: К 0,3 мл сыворотки крови добавить 0,6 мл реактива №1, перемешать и перенести по 0,3 мл в 2 пробирки. В I добавить 2,7 мл раствора №1 (контроль). Во II добавить 2,7 мл раствора №2 (опыт). Перемешать, инкубировать в течение 60 минут при комнатной температуре. На спектрофотометре (КФК-3) определяют оптическую плотность в кюветах
при 450 нм.Расчет: Высчитывают разность показателей оптической плотности, результат умножают на 1000 и получают количество ИК в 100 мл сыворотки. Ответ выражают в единицах оптической плотности.
- количество ЦИК в 100 мл сыворотки.Норма: 54,24 + 2,03 усл. ед.
Пример расчета: больной Максимов С.И., 19 лет.
Количество ЦИК в 100 мл сыворотки:
усл. ед.2.2.5. Определение уровня МСМ в крови (Габриэлен Н.И., 1984)
Метод основан на осаждении белков из исследуемой жидкости 10 % раствором ТХУ с последующем центрифугированием и определением абсорбции света супернатантом в 10 раз разведенным дистиллированной водой.
Ход работы: Сыворотку крови обрабатывают 10 % раствором ТХУ. В качестве контроля лучше использовать сам раствор ТХУ в 30 раз разведенный дистиллированной водой. Оптическая плотность его против воды составляет 0,123±0,012 усл. ед. на волне 254 нм при 23-25
С. Центрифигируем 3000 об/мин в течение 30 минут. К 0,5 мл надосадочной жидкости +4,5 мл дистиллированной воды. Измерение проводим на спектрофотометре в УФ свете при 280 нм для определения ароматических аминокислот и при длине волны 254 нм для определения нуклеотидов. Уровень МСМ выражают в единицах, количественно равных показателям экстинции.2.2.6. Определение показателей «эффективная концентрация
альбумина» и «общая концентрация альбумина» в сыворотке крови человека флуоресцентным методом
(Миллер Ю.И., 1994).
Принцип метода:
Метод основан на специфическом взаимодействии флуоресцентных органических соединений с альбумином в сыворотке крови. В зависимости от условий этого взаимодействия интенсивность флуоресценции красителя из альбумина отражает различные свойства белка. Индекс ЭКА/ОКА не зависит от числа молекул альбумина в пробе и характеризует физико-химические свойства молекулы альбумина.
Состав набора:
Реактив I (4 ампулы по 5 мл). Предназначен для приготовления раствора используемого при разбавлении сыворотки крови. Он содержит антикоагулянт ЭДТА.