Г. Антинуклеарные антитела
1. LE-клетки
а. Определение. LE-клетки (Lupus Erythematosus cells — клетки красной волчанки) — это нейтрофилы или моноциты, содержащие крупные гомогенные базофильные включения. Эти включения представляют собой фагоцитированные ядра разрушенных клеток, покрытые антинуклеарными антителами. LE-клетки выявляются у больных СКВ в плевральном, перикардиальном, перитонеальном выпоте, синовиальной жидкости и СМЖ. Эти клетки можно получить in vitro, добавив к сыворотке больного лейкоциты здорового человека и ядра разрушенных клеток. На определении LE-клеток основан первый лабораторный метод диагностики СКВ, разработанный в 1948 г.
б. Диагностическая значимость. Выявление LE-клеток — трудоемкий и недостаточно чувствительный метод лабораторной диагностики СКВ, поэтому сейчас в большинстве лабораторий для диагностики этого и других аутоиммунных заболеваний используются более простые, дешевые и воспроизводимые методы, основанные на определении антинуклеарных антител.
2. Определение антинуклеарных антител методом иммунофлюоресценции
а. Определение. Антинуклеарные антитела — это антитела, связывающиеся с теми или иными структурами клеточного ядра. Чаще всего для определения антинуклеарных антител используется непрямая иммунофлюоресценция.
б. Методы выявления. В качестве клеточного субстрата используются замороженные срезы, например пищевода обезьяны, печени крысы, или препараты, приготовленные из суспензии клеток с крупными ядрами, например из человеческих клеток линии HEp-2. Определение антинуклеарных антител проводят следующим образом: 1) клеточный субстрат инкубируют с исследуемой сывороткой; 2) отмывают от несвязавшихся сывороточных белков; 3) инкубируют в присутствии меченных флюоресцеином антител к человеческим иммуноглобулинам, после чего вновь отмывают; 4) исследуют с помощью флюоресцентного микроскопа. Антинуклеарные антитела, содержащиеся в исследуемой сыворотке, связываются с клеточным субстратом, а затем — с мечеными антителами против иммуноглобулинов. Если сыворотка не содержит антинуклеарных антител, меченые антитела, добавленные к клеточному субстрату, при отмывке удаляются (см. рис. 15.2). Для определения титра антинуклеарных антител исследование проводят с серийными разведениями исследуемой сыворотки. Каждая лаборатория сама устанавливает нормальные показатели титра антинуклеарных антител, поскольку они зависят от типа клеточного субстрата и способа его фиксации. Чаще всего для выявления антинуклеарных антител используется культура человеческих клеток HEp-2 (клетки рака гортани), содержащих много ядерных антигенов: Ro/SS-A, ядерный антиген пролиферирующих клеток и антигены центромеры. Использование меченых антител к разным классам иммуноглобулинов показало, что большинство антинуклеарных антител относятся к IgG.
в. Диагностическая значимость. Основная цель исследования антинуклеарных антител — исключить СКВ, поскольку при этом заболевании антинуклеарные антитела появляются в сыворотке 95% больных в течение 3 мес после начала заболевания. Антинуклеарные антитела выявляются не только при СКВ, они могут обнаруживаться у пожилых, появляются при применении некоторых лекарственных средств, а также при некоторых артритах (см. табл. 15.2). Если титр антинуклеарных антител повышен, необходимо определить, к какому антигену они направлены (см. табл. 15.3), так как при разных аутоиммунных заболеваниях выявляются антинуклеарные антитела разной специфичности (см. гл. 15, п. II.Д). Титр антинуклеарных антител не позволяет судить об активности заболевания и эффективности лечения.
1) Тип окрашивания (характер распределения флюоресцентной метки в клетках) при разных заболеваниях неодинаков и определяет направление дальнейшего исследования антинуклеарных антител. Исследуемая сыворотка может содержать антинуклеарные антитела разной специфичности, однако тип окрашивания определяется теми антителами, которые присутствуют в наибольшем титре.
а) Диффузное окрашивание (равномерное распределение метки) наименее специфично и встречается чаще всего при СКВ, лекарственном волчаночном синдроме и других аутоиммунных заболеваниях, а также у пожилых (см. табл. 15.2). При диффузном окрашивании клеток реакцию повторяют с большим разведением исследуемой сыворотки. Если тип окрашивания остается прежним, наиболее вероятно, что антиген, против которого направлены антинуклеарные антитела, — дезоксирибонуклеопротеид.
б) Периферическое окрашивание наблюдается, когда в исследуемой сыворотке преобладают антитела к ДНК (см. гл. 15, п. II.Д.1). Этот тип окрашивания часто встречается при волчаночном нефрите.
в) Пятнистое окрашивание обусловлено антителами к экстрагируемым ядерным антигенам (см. гл. 15, п. II.Д.2) и обычно наблюдается при системной склеродермии, смешанном заболевании соединительной ткани, синдроме Шегрена, лекарственном волчаночном синдроме.
г) Нуклеолярное окрашивание (распределение метки в районе ядрышек) обусловлено антителами к рибонуклеопротеиду (см. гл. 15, п. II.Д.2). Этот тип окрашивания характерен для системной склеродермии, изредка встречается и при других аутоиммунных заболеваниях.
Д. Исследование специфичности антинуклеарных и других аутоантител
1. Антитела к ДНК
а. Методы выявления. Антитела к нДНК можно обнаружить с помощью реакции связывания комплемента, реакции агглютинации частиц бентонита, покрытых ДНК, метода иммунодиффузии и других иммунологических методов. Чаще всего используют метод, основанный на связывании антител с ДНК, меченной 125I. Суть метода заключается в следующем: 1) исследуемую и контрольную (нормальную) сыворотку смешивают с раствором ДНК, меченной 125I; 2) для осаждения образовавшихся комплексов (IgG—ДНК) к сыворотке добавляют антитела к IgG или 50% раствор сульфата аммония (см. рис. 15.3). В контрольной сыворотке в осадок выпадает 10—20% ДНК. Если в исследуемой сыворотке в осадок выпадает больше ДНК, чем в контрольной, значит, содержание антител к нДНК в исследуемой сыворотке повышено. Это указывает на тяжелую СКВ или волчаночный нефрит. Антитела к нДНК можно также выявить с использованием ДНК Crithidia lucillae (представитель жгутиковых). Хотя этот метод довольно чувствителен, он не позволяет оценить титр антител к ДНК, поэтому для оценки активности СКВ его не используют.
б. Диагностическая значимость. Антитела к нДНК характерны для волчаночного нефрита и других тяжелых проявлений СКВ. Серийное определение антител к ДНК используется для оценки эффективности лечения этого заболевания. Хотя определение антител к ДНК менее чувствительно, чем определение антинуклеарных антител методом иммунофлюоресценции, оно имеет следующие преимущества: 1) антитела к нДНК более специфичны для СКВ, чем остальные антинуклеарные антитела; 2) по уровню этих антител можно оценить риск и тяжесть волчаночного нефрита (с увеличением титра антител к ДНК возрастают риск и тяжесть волчаночного нефрита). Необходимо учитывать, что коммерческие препараты ДНК содержат не только двух-, но и одноцепочечные молекулы, а антитела к одноцепочечной ДНК выявляются при системной склеродермии, ревматоидном артрите, дерматомиозите, хроническом активном гепатите, лекарственном волчаночном синдроме, вызванном прокаинамидом, гидралазином, изониазидом, триметадионом, метилдофой и фенотиазинами. Примесь одноцепочечной ДНК можно удалить с помощью хроматографии. Если возникают сомнения в результатах исследования, необходимо проверить чистоту используемого препарата ДНК.
в. Роль в патогенезе аутоиммунных заболеваний. Антитела к ДНК обнаруживаются в почках (в виде иммунных комплексов) и в сыворотке больных СКВ. Поскольку эти антитела связывают и активируют комплемент, они способствуют разрушению клеток и активируют нейтрофилы и макрофаги.
2. Антитела к экстрагируемым ядерным антигенам
а. Определение. Некоторые ядерные антигены, в отличие от ДНК, легко экстрагируются солевыми растворами (см. табл. 15.3). Экстрагируемые ядерные антигены включают Sm-антиген (от Smith — фамилия больного СКВ, у которого впервые был выявлен этот антиген), рибонуклеопротеид (в отличие от Sm-антигена, он расщепляется рибонуклеазой и трипсином), антигены Ro/SS-A и La/SS-B.
б. Методы выявления. Антитела к экстрагируемым ядерным антигенам можно определять с помощью метода, описанного в гл. 15, п. II.Г.2.б. Если исследуемая сыворотка содержит антитела к экстрагируемым ядерным антигенам, то интенсивность свечения срезов тканей после экстракции антигенов солевым раствором будет меньше, чем до экстракции. Другой способ выявления этих антител основан на преципитации экстрагированных ядерных антигенов исследуемой сывороткой в геле (метод иммунодиффузии). Применяют также метод непрямой иммунофлюоресценции, основанный на использовании чистого антигена: 1) на предметное стекло наносят каплю раствора антигена и высушивают ее, 2) пятно обрабатывают исследуемой сывороткой (в качестве контроля используют нормальную сыворотку), а затем — меченными флюоресцеином антителами к человеческим IgG, 3) избыток меченых антител удаляют отмыванием. Флюоресценция становится заметной при освещении стекол ультрафиолетовым светом: если светится только пятно, обработанное исследуемой сывороткой, значит, она содержит антитела к экстрагируемым ядерным антигенам.