Впровадження результатів роботи у практику. Результати дисертаційної роботи впроваджено у лікувально-діагностичну практику неврологічних відділень Львівської обласної клінічної лікарні (ОКЛ), 5-ї міської клінічної лікарні м. Львова, 1120 центрального військового клінічного госпіталю, Івано-Франківської ОКЛ, 4-ої міської клінічної лікарні м. Київ, 1-ої міської поліклініки м. Дніпропетровська, Ужгородської ОКЛ, міської клінічної лікарні №7 м. Харкова, кафедри нервових хвороб національного медичного університету ім. Пирогова м. Вінниці.
Особистий внесок дисертанта. Дисертація є самостійною працею здобувача. Автор самостійно проаналізувала літературу за темою дисертації, особисто провела клініко-неврологічне обстеження, обробку первинної документації й розподіл хворих на групи, оволоділа методами імунобіологічного дослідження крові та брала участь у їх проведенні. Дисертант проводила лікування обстежених хворих із застосуванням Бетаферону на базі неврологічних відділень ЛОКЛ та 5-ої МКЛ. Статистичну обробку результатів досліджень, їх аналіз та висновки зроблено при безпосередній участі автора. Здобувачем самостійно написані всі розділи дисертації. Формулювання мети і завдань роботи та впровадження результатів дослідження у медичну практику, написання статей за темою роботи здійснено спільно з науковим керівником. Консультативну допомогу та сприяння при виконанні лабораторних досліджень за темою дисертаційної роботи надав член-кореспондент НАН України, д. б. наук, професор Р. С. Стойка.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації доповідалися на науково-практичній конференції, присвяченій 100-річчю кафедри неврології ЛНМУ ім. Данила Галицького: "Проблеми клінічної неврології: історія, сучасність, перспективи" (Львів, 2005); на конференціях Львівського обласного товариства неврологів (2005, 2006), Львівського міського товариства неврологів (2005, 2006), на 5-ій Парнасівській конференції “Молекулярні механізми клітинної сигналізації” (Київ, 2005), 9-му з'їзді Українського біохімічного товариства (Харків, 2006), ІІІ національному конгресі (ХІ з'їзді) неврологів, психіатрів та наркологів України “Профілактика та реабілітація в неврології, психіатрії та наркології” (Харків, 2007).
Публікації. Основні положення дисертації опубліковано у 12-ти наукових працях: 8 статей та 4 тез доповідей на міжнародних та вітчизняних конференціях. Серед статей – 5-ть у фахових наукових виданнях, рекомендованих ВАК України, з них 2 роботи - самостійні. Оформлено 1 інформаційний лист.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 196 сторінках друкованого тексту, складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методик обстеження хворих, 4 розділів і 6 підрозділів власних досліджень, висновків, практичних рекомендацій та додатків. Робота ілюстрована 33 таблицями, 20-ма рисунками, 1 схемою і містить 146 сторінок основного тексту. Список літератури складається з 229 літературних джерел (із них 112 кирилицею та 117 латиницею).
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали та методи дослідження. З метою вирішення визначених завдань, у період з 2004 по 2005 рр. неврологічно, інструментально та лабораторно обстежено 216 хворих на РС – жителів м. Львова та Львівської області. Метою І-го етапу досліджень стала клініко-епідеміологічна характеристика РС у межах різних районів м. Львова та області, яка включала порівняльний аналіз клінічних показників цього захворювання на екологічно чистих (ЕЧ) та екологічно забруднених (ЕЗ) територіях (173 хворих на РС і 128 клінічно здорових осіб). Підставою для формування поняття ЕЗ та ЕЧ райони стали дані санітарно-епідеміологічної служби Львівської області, згідно яких забрудненість грунтів Яворівського району, в якому розташований Яворівський державний гірничо-хімічний комбінат “Сірка”, є найвищою по області - 16,2% зразків із перевищенням граничнодопустимих концентрацій, водночас, найменше забрудненим виявився Буський район. У межах м. Львова порівнювали Франківський район, на території якого розташовано танкоремонтний завод, автомобільний завод та інші промислові підприємства, із Сихівським районом, який безпосередньо межує із лісосмугою і не містить жодних великих промислових об’єктів. Особливістю цього розділу виконаних досліджень був метод детального неврологічного огляду кожного хворого з встановленням достовірного діагнозу із використанням спеціально розробленої Інститутом неврології, психіатрії та наркології АМН України анкети-опитувальника.
У 38-ми хворих на РС та 27-ми здорових осіб (ІІ-й етап) досліджували здатність Ig, виділених із їх плазми крові, впливати на імунокомпетентні клітини. У дисертаційній роботі цей розділ представлений на прикладі випадкової вибірки хворих на РС (14 хворих і 6 осіб контрольної групи), оскільки всі закономірності, отримані в загальній групі, виявилися ідентичними, до тих змін, які отримали у цій вибірці.
У 9-ти хворих на РС та 6-ти донорів (ІІІ-й етап) досліджували здатність IgG, виділених із їх плазми крові, до руйнування ОБМ та ДНК.
Вплив лікування Бетафероном на ознаки апоптозу в імунокомпетентних клітинах досліджували у 10-ти хворих на РС та 10-ти здорових осіб (IV-й етап).
Для діагностики РС використовували критерії C. Poser et al. (1983) і Mc. Donald et al. (2005). Діагноз РС ставили на основі уважного виявлення і вивчення скарг, анамнезу захворювання та параклінічних (МРТ) методів обстеження хворих. При необхідності долучали консультації інших спеціалістів та серологічні обстеження крові на токсоплазмоз, бореліоз, герпесвірусну персистенцію, що дозволило виключити інтеркурентну патологію, передусім інфекційні та хронічні захворювання внутрішніх органів.
Виділення фракції імуноглобулінів із плазми венозної крові. Виділення імуноглобулінової фракції з плазми венозної крові проводили за описаною методикою (Фримель Г., 1997). Для дослідження каталітичної активності препаратів IgG використали афінну хроматографію на колонці, наповненій протеїн A – агарозою Fast Flow (Sigma, США). Для перевірки чистоти IgG, препарати піддавали гель-фільтрації на колонці розміром 180 х 5 мм, яка містила сорбент Toyopearl TSK HW-55 (Toyo Soda, Японія). На кінцевій стадії білки фракціонували електрофорезом у 12% ПААГ у присутності 0,1% SDS.
Дослідження цитотоксичної дії Ig. Як об’єкт для дослідження цитотоксичної й проапоптичної дії Ig використали людські лейкемічні Т-лімфоцити ліній Jurkat і MT-4; лейкемічні В-клітини лінії Namalwa (лімфома Беркітта); лейкемічні В-лімфоцити миші (лінія L-1210). Усі лінії клітин були отримані з колекції Інституту експериментальної патології, онкології та радіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України (м. Київ, Україна). Клітини культивували у флаконах Карреля у поживному середовищі RPMI-1640 (Sigma, США) із додаванням 10% сироватки крові ембріонів ВРХ (Sigma, США), 50 мкг/мл гентаміцину (Sigma, СШA) до досягнення клітинами субконфлюентного стану. Для перевірки життєздатності клітин через 24 години дії на них препаратів Ig використовували тест із фарбуванням клітин 0,1% водним розчином трипанового синього. Кількість незафарбованих живих та зафарбованих у синій колір (мертвих) клітин підраховували у гемоцитометричній камері (камера Горяєва) під світловим мікроскопом Біолам (ЛОМО, Санкт-Петербург, РФ).
Визначення проапоптичної активності Ig плазми крові хворих на РС проводили за методом G. Zauli (1993), використовуючи електрофорез тотальної ДНК моноядерних клітин периферійної крові (МКПК) хворих на РС. Розподіл фракцій деградованої ДНК визначали, використовуючи програму Gel-Pro 3.1. “Кометний” аналіз ДНК МКПК хворих на РС проводили, як описано у роботі Камінський В.О. та співавт. (2005). Підрахунок кількості комет ДНК проводили під мікроскопом при збільшенні Ч 200-400. У зразку рахували не менше 500 клітин. Комети поділяли на 5 класів залежно від співвідношення ДНК у "голові" та "хвості" комети.
Дослідження каталітичної дії Ig плазми крові.
1. Гідроліз ОБМ. IgG досліджували, як описано у роботі Latry V. at al. (2003).
2. Визначення зв’язування ОБМ імуноглобулінами плазми крові за допомогою імуноферментного аналізу (ІФА). ІФА здійснювали, як описано в Vojdani A. et al. (2003).
3. Активність IgG щодо гідролізу ДНК. ДНК-азну активність IgG визначали, як описано (Gabibov A.G. et al., 2000).
Статистична обробка отриманих результатів. Статистичне опрацювання результатів з визначення цитотоксичної дії препаратів Ig здійснювали за допомогою програми OriginPro 7.0, вираховуючи t-критерії Стьюдента. Достовірними вважали зміни показників за умови Р<0,05.
Результати власних досліджень та їх обговорення. Згідно з результатами проведених нами досліджень (1-й етап), серед 173-х обстежених хворих переважали жінки над чоловіками (1,33:1), що підтверджує участь гормональної дисфункції в патогенезі РС. Показали деякі відмінності у порівнянні з даними літератури щодо вищої частоти захворювання в осіб віком 40 - 49 років (43,93%). Кількість хворих віком понад 50 років також виявилася вагомою (29,48%). Ймовірно, така перевага (73,41%) хворих старших 40 років й обумовлює злоякісність перебігу РС у західному регіоні України, зокрема у Львівській області. Найбільша кількість хворих мала тривалість захворювання понад 10-ть років (57,79%) і від 6-ти до 10-ти років (26,59%). Виявили статистично вірогідну більшу кількість хворих із тривалістю захворювання від 1-го до 5-ти років та від 6-ти до 10-ти років у ЕЗ порівняно з ЕЧ районами Львівської області. Кількість обстежених хворих із церебро-спінальною клінічною формою була найбільша порівняно із церебральною та спінальною (54,91% проти 28,9% та 16,18% відповідно) з перевагою у ЕЗ районах. Серед оглянутих хворих на РС переважали пацієнти із РР і ВП типами перебігу патологічного процесу (по 39,3% у кожній підгрупі). 20,8% пацієнтів перебували на етапі первинного прогресування, що є значно вищим відсотком порівняно з даними літератури (10-15%) (Вінничук С.М. та співавт., 2000; Завалишин И.А. и соавт., 2002; Соколова Л.І., 1998; Montablan X., Rio J., 2001; Runmarket B., Andersen O., 1993), і може пояснити агресивність перебігу РС у нашому регіоні. Водночас, кількість хворих на стадії вторинного прогресування виявилася вагомішою в ЕЗ порівняно з ЕЧ районами. Найбільшу кількість хворих на РС було виявлено із середньої тяжкості (42,19%) та тяжкими (50,87%) проявами патологічного процесу, з перевагою останніх у ЕЗ районах області.