Обработка яйцеклетки
Предовуляторная яйцеклетка человека может быть обнаружена невооруженным глазом по наличию в аспирате массивных и клейких хлопьев размером до 5 мм и более. Однако важно убедиться, что яйцеклетка действительно находится в этих хлопьях путем их просмотра в препарационном микроскопе.
Яйцеклетка 2 раза обмывается оплодотворяющей средой, которая удаляет большую часть фолликулярной жидкости. Затем она переносится в капле равновесной оплодотворяющей Среды под стерильное парафиновое масло. В качестве оплодотворяющей среды применяется раствор Тироде, содержащий пируват, альбумин, антибиотики.
Приготовление сперматозоидов
Для получения свежей спермы, мужа больной просят собрать свой эякулят в стерильный контейнер в отдельной комнате. Сперму с учетом ее разжижения при комнатной температуре разводят в 2 смывах оплодотворяющей среды. Удаление семенной плазмы производят следующим образом. Небольшое количество спермы разводят в 4-кратном объеме оплодотворяющей среды, затем суспензию сперматозоидов центрифугируют, удаляют надсадочную жидкость, ресуспензируют комочек сперматозоидов и повторяют эту процедуру. Полученный таким образом комочек сперматозоидов вновь ресуспендируют, определяют их концентрацию и подвижность и доводят эти параметры до значений, которые считаются стандартными для процедуры оплодотворения яйцеклетки.
Оплодотворение
Затем сперматозоиды переносят в специальный термостат, где уже находятся яйцеклетки. При осеменении на 1 яйцеклетку добавляют 200000-300000 сперматозоидов.
Процесс культивирования происходит в специальной среде с абсолютной влажностью, при температуре 37оС в растворе с рН, равным приблизительно 7,6, в атмосфере, содержащей 5% СО2, 5% О2 и 90% N2. Яйцеклетку оставляют в суспензии сперматозоидов на 6-18 ч.
Следующие морфологические особенности яйцеклетки, большинство которых может быть выявлено с помощью микроскопа, могут определить признаки произошедшего оплодотворения:
1. Выталкивание второго полярного тельца в желточное пространство.
2. Цитоплазма яйцеклетки сжимается, отступая от оболочки.
3. В ранней стадии оплодотворения в цитоплазме яйцеклетки может наблюдаться головка, срединный сегмент и хвост сперматозоида. Эти признаки могут отмечаться только при сильном увеличении, используя фазово-контрастную методику.
4. В более поздние стадии (около 12-18 ч после инсеминации) в цитоплазме могут быть мужские и женские проядра.
Деление зиготы
После завершения периода инсеменации яйцеклетку переносят в равновесную каплю среды по парафиновое масло. Среда состоит из свежеприготовленного раствора Ham F10 с добавлением 15% сыворотки крови больной. Растущий эмбрион человека культивируется при температуре 37оС в атмосфере, содержащей 5% СО2, 5% О2 и 90% в среде с рН, равным 7,3.
О нормальном развитии эмбриона в культуре свидетельствует появление делящихся клеток приблизительно одинакового размера и формы, которые равномерно заполняют большую часть пространства в пределах блестящей оболочки. Деление клеток должно быть нарастающим и наблюдаться во время четко определенного времени. Так, эмбрион должен содержать 2 клетки через 35-46 часов, 4 клетки через 51-63 часа, 8 клеток через 68-86 часов после инсеминации, а стадия 16 клеток должна быть достигнута в пределах 84-112 часов после.
Если клетки развивающегося эмбриона имеют неправильную форму или отходят от блестящей оболочки, или же скорость деления клеток существенно отличается от описанной выше, то развитие эмбриона считается патологическим и он непригоден для переноса в полость матки.
Перенос эмбриона
Так как в большинстве случаев эмбрион переносится в полость матки на стадии 8 или 16 клеток, то это означает, что эмбрион человека перед имплантацией должен содержаться в культуре в течение 3-4 суток.
Эмбрион в 0,05 мл культуральной среды осторожно засасывается в стерильный катетер диаметром 1,4 мм. Затем катетер проводится черезцервикальныйканал в полость матки, где в области дна эмбрион высвобождается из катетера. С целью облегчения проведения этой процедуры катетер следует разместить по длине для контроля положения его конца в полости матки. Помимо этого, следует очень аккуратно манипулировать шейкой матки во избежание сокращения мышц матки.
Контроль подтверждения беременности
Для контроля ранних сроков развивающейся беременности проводят динамическое определение -субъединицы хорионического гонадотропина, которое помогает определить беременность с 7-9-го дня после ТЭ. При наступлении беременности за женщинами ведется постоянное наблюдение методами, принятыми для ведения беременности и родов женщин с отягощенным акушерским анамнезом.
Должно производиться серийное ультразвуковое обследование плода. На 1-7-й неделе беременности определяется положение амниона и сердечная деятельность плода. После этого контроль должен производиться на 20‑й,28-й неделе и далее с целью определения степени развития плода. На основании полученной информации можно наблюдать характеристики роста плода на протяжении беременности и выявить определенную патологию развития скелета. Пункцию амниона можно производить приблизительно на 16-й неделе беременности. Таким образом, может быть определен кариотип и уровень a-фетопротеинов, определяющий наличие дефектов развития нервной трубки плода.
Список литературы:
1. Никитин А.И. "Акушерство и гинекология", 1989, №8
4. Пшеничникова Т.Я., "Бесплодие в браке", Москва, 1991
5. Акунц К.Б., "Актуальные вопросы бесплодия в браке", Ереван, 1979
6. Пшеничникова Т.Я., "Бесплодный брак (проблемы и перспективы)", М. 1989