Апробация работы.
Результаты исследований доложены на XI-й и XII-й научных конференциях молодых ученых академии (ВМедА, Ленинград, 1990; ВМедА, Санкт-Петербург, 1992), на
VI-м Всесоюзном биохимическом съезде (Санкт-Петербург, 1992), на Первой международной региональной конференции по ВИЧ-инфекции "Социальные и медицинские проблемы СПИДа" (Санкт-Петербург, 1994). на заседании Санкт-Петербургского отделения Российского научного общества инфекционистов (Санкт-Петербург, 1996), на IV международной конференции "СПИД, рак и родственные проблемы" (Санкт-Петербург. 1996), на III Всероссийском съезде гематологов и трансфузиологов (Санкт-Петербург. 1996). Материалы диссертации использованы в отчетах по теме НИР N 50-93-В12 "Биохимические механизмы формирования иммунодефицитов под влиянием ВИЧ и иммунодиагностика иммунодефицитных состояний больных СПИДом" и по теме НИР N 60-95-П4 "Исследование роли системы белков теплового шока в патогенезе ВИЧ-инфекции".
Реализация результатов работы.
По теме диссертации опубликовано 7 научных работ. Результаты работы используются в практике учебного процесса и научно-исследовательской работе кафедры инфекционных болезней, кафедры клинической биохимии и лабораторной диагностики, в работе НИЛ СПИДа и инфекционных заболеваний в ВС РФ Военно-медицинской академии, кафедры инфекционных болезней Семипалатинского государственного медицинского института, кафедры ЛОР-болезней с курсом аллергологии и иммунологии Чимкентского государственного медицинского института, кафедры инфекционных болезней Волгоградского государственного медицинского университета.
Объем и структура диссертации.
Диссертация изложена на 171 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, пяти глав собственных исследований. обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 61 отечественный и 140 зарубежных источников. Диссертация иллюстрирована 24 рисунками и 17 таблицами.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Общая характеристика больных и методов исследования
В процессе работы были обследованы 34 инфицированных и больных ВИЧ-инфекцией, среди которых преобладали лица мужского пола в возрастной категории от 20 до 39 лет. Клиническое наблюдение и обследование больных проводили в больнице N 30 имени С.П. Боткина г.Санкт-Петербурга, Республиканской клинической инфекционной больнице г. Усть-Ижоры Ленинградской области, в Центре по борьбе и профилактике СПИДа г.Санкт-Петербурга.
Больные были распределены по группам в соответствии с клинической классификацией В.И.Покровского (1989). Вич-инфицированных в стадии инкубации и больных в терминальной стадии не обследовали. Контрольную группу составили 25 практически здоровых мужчин (доноров крови) в возрасте от 20 до 39 лет - военнослужащие.
Иммунологические и биохимические исследования проводили в Военно-медицинской академии, определение белков теплового шока - на базе института цитологии Академии наук.
Диагноз ВИЧ-инфекции верифицировали серологически - по наличию в крови специфических антител к ВИЧ с помощью тест-систем для гетерогенного иммуноферментного анализа методом двойных антител (производства фирм СП"ДиаПЛЮС". Россия-Швейцария, СП"Авиценна", Россия-Сирия). Результаты иммуноферментного анализа подтверждали с помощью иммуноблотинга ("Du Pont", США).
Для оценки иммунного статуса у обследованных пациентов изучали следующие показатели: количество лейкоцитов, лимфоцитов; субпопуляции Т-лимфоцитов с помощью проточного цитофлюориметра "EPICS-C" (Coulter elektronics. США-Франция) с применением моноклональных антител фирмы "Ortho Diagnostic Systems"(США): РТМЛ с КонА определяли по методу M.George. J.H.Vaughan (1962); количество В-лимфоцитов, несущих Ig M, G, А, определяли методом иммунофлюоресценции с использованием моноспецифических сывороток к иммуноглобулинам человека; концентрации Ig M. G, А, определяли методом радиальной иммунодиффузии в геле (Mancini С. et al.. 1963); содержание циркулирующих иммунных комплексов по методу Ю.А.Гриневича. А.Н.Алферова (1981).
Для исследования системы белков теплового шока в мононуклеарах периферической крови ВИЧ-инфицированных была получена панель поликлональных антител. При иммунизации животных и аффинной очистки антител применяли препарат белков БТШ-70. Для получения препарата БТШ-70 использовали белковый экстракт, полученный из мышечной ткани крупного рогатого скота и клеток культуры HeLa. Выделяли препарат методами ионообменной (с DEAE-сефарозой; и аффинной(с АТФ-агарозой) хроматографии. Чистоту полученных белков БТШ-70 проверяли при помощи электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. Препарат БТШ-70 имел чистоту около 98% и содержал смесь конститутивной (hsc-70) и индуцибельной (hsp-70) изоформ семейства БТШ-70.
Из иммунной сыворотки кроликов выделяли антитела к БТШ-70 методами высаливания и аффинной хроматографии на колонках со смесью белков hsc-70 и hsp-70. Каждая серия антител подвергалась проверке на специфичность двумя методами - иммуноферментного анализа и иммуноблоттинга. Для определения эпитопов БТШ-70, с которыми реагировали полученные антитела, использовали "сэндвич"-метод иммуноферментного анализа и реакция иммунопреципитации с предварительным мечением белков [35S]-метионином. Иммунопреципитаты были подвергнуты одно- и двумерному электрофорезу (Laemli U.K., 1970; O'Farrel P.H.. 1978). Поликлональные антитела использовали в конструкции иммуноблотинга с последующей денситометрией проявленных зон белков, что позволяло полуколичественно оценивать содержание изоформ семейства БТШ-70 в мононуклеарах периферической крови больных.
Для проверки функционального состояния системы БТШ-70 мононуклеаров периферической крови служили нагрузочные тесты In vitro - тепловой шок (прогрев клеток при 43±0.3° С в водяном термостате) и ультрафиолетовое облучение с использованием прибора МД-73 "Изольда".
Определение активности ксантиноксидазы и ее формы в мононуклеарной фракции крови проводили по методу У.Прайор (1979). Уровень процессов свободнорадикального окисления тотально в мононуклеарах периферической крови и отдельно в их ядрах оценивали по содержанию продуктов, связывающих тиобарбитуровую кислоту, которые определяли по методу M.Uchlyama, M.Michara (1978). В качестве интегральных биохимических показателей нестабильности генома клеток были избраны относительная доля продуктов деградации хроматина - полидезоксинуклеопротеидов, которые являются фрагментами ДНК, (Parks D.A., Granger D.N., 1986) и интенсивность образования однонитевых разрывов ДНК (Birnboim H.C.. Jewcac J.J.. 1981).
Статистическая обработка цифровых данных осуществляли методом вариационной статистики с использованием параметрического критерия (t) Стьюдента. В случае малых выборок использовали непараметрические статистические критерии. Расчеты производили с использованием программы STATGRAF (Statistical Graphics System), версия 2.1.
2. Результаты собственных исследований Гуморальный и клеточный иммунитет на разных стадиях болезни
Исследование изменений в иммунной системе при развитии ВИЧ-инфекции имело целью выявить показатели, достоверно изменяющиеся при переходе от одной клинической стадии (фазы) к другой.
Анализ изменений иммунологических параметров больных позволяет заключить, что в динамике ВИЧ-инфекции, в первую очередь, происходит прогрессирующее снижение функциональной состоятельности иммунной системы по мере развития клинической картины заболевания. Выявленная дефектность иммунного статуса касается, прежде всего. Т-системы иммунитета. Однако далеко не все исследованные традиционные иммунодиагностические параметры в своей динамике достоверно отражают начало перехода от бессимптомной фазы заболевания к манифестным стадиям. Достоверное различие между группами больных ВИЧ-инфекцией наблюдалось у следующих показателей:
- при переходе от бессимптомной фазы (IIБ) к ПГЛ (IIB) - увеличение относительного содержания лимфоцитов от 39,00±2,13 до 45,92±1.96% (р<0,05), уменьшение содержания СD8+-лимфоцитов (супрессоров) ОТ 36,90±2.90 до 27,83±1,80% (p<0,01);
- при переходе от ПГЛ (IIB) к стадии вторичных заболеваний (IIIA) - увеличение содержания В (IgA+) -лимфоцитов от 0,06±0,01 до 0,10±0,01xlO9/л (p<0,01), увеличение концентрации IgG от 11,74±0.89 до 13.77±0.66 г/л (р<0.05), увеличение содержания циркулирующих иммунных комплексов - уменьшение пропускания светового потока от 92,1±1,2 до 84.3±1.6% (р<0,01).
Как показал анализ, процентные (относительные) показатели во многих случаях нельзя использовать без оценки абсолютных значений. абсолютное содержание В(IgA+)-лимфоцитов, остается неизменным на стадии IIIA по сравнению с бессимптомной фазой, изменение концентрации иммуноглобулинов IgG происходят в диапазоне нормальных значений (9-15 г/л), что снижает прогностическую информативность указанных показателей. Важен и тот факт, что нет единого иммунологического показателя, который бы достоверно характеризовал оба перехода ВИЧ-инфекции - от бессимптомной фазы к генерализованной лимфаденопатии и от генерализованной лимфаденопатии к стадии вторичных заболеваний.
Содержание продуктов, связывающих тиобарбитуровую кислоту, в мононуклеарах периферической крови
Уже в бессимптомной фазе у ВИЧ-инфицированных отмечается увеличение средних значений содержания ТБК-связывающих соединений в мононуклеарах периферической крови на 56%, а в их ядрах - на 90%. По мере развития заболевания уровень названных продуктов свободно-радикального окисления возрастает, достигая максимума у больных в стадии IIIB. При этом средние значения в группе больных в стадии IIIB превышали контрольные в 3.2 раза в мононуклеарах и в 4,6 раза в ядрах мононуклеаров. Однако достоверный рост показателей свободнорадикального окисления между группами больных ВИЧ-инфекцией отмечается в мононуклеарах. но не в ядрах, и только в одном из интересующих нас переходах клинического течения - из бессимптомной фазы (ПБ) к ПГЛ (IIB) от 2,82±0,30 до 3,61±0.37 нмоль/106 клеток (р<0,01).