Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати досліджень можуть бути використані токсикологами, біологами, фармацевтами та фармакологами, а також фахівцями, які здійснюють профілактику та лікування свинцевої інтоксикації. Розроблені додаткові критерії вазотоксичної дії свинцю та запропонований метод експериментальної оцінки вазотоксичної дії свинцю можуть застосовуватись у токсиколого-гігієнічних дослідженнях. Отримані експериментальні дані відображені у розроблених за участю автора інформаційного листа „Патогенетично обґрунтовані критерії кардіо-вазотоксичної дії свинцю” (№ 050-07) та патентах „Спосіб експериментальної оцінки вазотоксичної дії свинцю” (№ 26627 від 25.09.2007), „Спосіб профілактики та лікування свинцевої інтоксикації”( №26628 від 25.09.2007), „Спосіб застосування екстракту S. coronata для профілактики та лікування свинцевої інтоксикації” (№26997 від 10.10.2007).
Особистий внесок здобувача. Автором обрано і обґрунтовано напрямок наукової роботи, виконано патентно-інформаційний пошук по даній проблемі, проведено постановку та планування експерименту, здійснено моделювання свинцевої інтоксикації у дослідних тварин, проведено гематологічні дослідження та вивчення скоротливої функції судинної стінки. Спільно із с.н.с. Інституту біохімії НАНУ А.В. Коцюрубою проведено біохімічні дослідження, спільно із с.н.с. Інституту медицини праці І.М. Андрусишиною визначено вміст свинцю у біологічних середовищах дослідних тварин. Автором дисертації проведена статистична обробка даних та аналіз отриманих результатів досліджень, розроблені додаткові критерії вазотоксичної дії свинцю, обґрунтовано та експериментально доведено доцільність застосування глутаргіну та екстракту S.coronata у якості лікувально-профілактичних засобів при свинцевій інтоксикації.
Апробація результатів дисертації. Матеріали даної дисертаційної роботи були представлені та обговорені у доповідях на конференціях молодих вчених Інституту медицини праці АМНУ (2004-2007рр.), в матеріалах науково-практичної конференції „Глутаргін у клініці внутрішніх хвороб” (Харків, 2005), ІІ науково-практичній конференції молодих вчених та спеціалістів „Актуальні проблеми фармакології та токсикології” (Київ, 2005), 10-й Пущинській школі-конференції молодих вчених „Биология – наука ХХІ века” (Російська Федерація, Пущіно, 2006), ІІ конгресі фармакологів (Одеса, 2006), науково-практичному семінарі „Серцево-судинні захворювання – 2006” (Київ, 2006), міжнародній науковій конференції „Лекарственные средства и биологически активные соединения” (Білорусія, Гродно, 2007), III міжнародній науковій конференції „Актуальные проблемы экологии – 2007” (Білорусія, Гродно, 2007).
Публікації. За результатам дисертаційної роботи опубліковано 14 наукових праць, у тому числі 3 статті у наукових фахових журналах, що входять до переліку ВАК України, 7 – у тезах конгресів, з’їздів, конференцій. Отримано 3 патенти України на корисну модель, видано інформаційний листок.
Структура і обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, аналітичного огляду літератури, опису методів дослідження, трьох розділів власних досліджень, обговорення отриманих результатів, висновків та списку літератури. Загальний обсяг дисертації становить 235 сторінок комп’ютерного друку. Дисертація ілюстрована 65 рисунками та 7 таблицями. Бібліографія включає 356 джерел, з них 164 іноземних найменувань.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали і методи досліджень
Дослідження проводили у субхронічному експерименті (1 міс. затравки) на статевозрілих щурах-самцях лінії Вістар вагою 160-185 г. після проходження ними 14-денного карантину. Тварини утримувались у загальноприйнятих умовах віварію із вільним доступом до питної водогінної води по 8-10 тварин у кожній групі. Групи дослідних щурів, шлях введення та доза застосованих препаратів подано у таблиці 1. Усього в експерименті використано 140 тварин.
Екстракт, що містив 5 % екдістероїдів, готували із надземної частини у фазі цвітіння рослини S. coronata , яка була вирощена на дослідних ділянках в національному парку „Олександрія” (м. Біла Церква). Екстракцію, ідентифікацію і ліофілізацію проводили за методикою Ю.Д. Холодової на базі Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАНУ.
Таблиця 1. Групи дослідних щурів.
| № групи | Речовина (препарат), яка застосовувалась | Доза та шлях введення |
| 1 серія – 1 місяць експозиції | ||
| 1. (контрольна) | Фіз. р-н | 1 мл в/о |
| 2. | Ацетат свинцю на фіз. р-ні | 1,53 мг/кг в/о |
| 3. | Ацетат свинцю на фіз. р-ні + глутаргін | 1,53 мг/кг в/о 100 мг/кг з їжею |
| 4. | Ацетат свинцю на фіз.р-ні + водний р-н екстракту S. coronata | 1,53 мг/кг в/о 20 мг/кг з їжею |
| 5. | Фіз. р-н + глутаргін | 1 мл в/о 100 мг/кг з їжею |
| 6. | Фіз. р-н + водний р-н екстракту S. coronata | 1 мл в/о 20 мг/кг з їжею |
| 2 серія – 1 місяць експозиції + 1 міс. постекспозиційного періоду | ||
| 7.(контрольна) | Фіз. р-н | 1 мл в/о |
| 8. | Ацетат свинцю на фіз. р-ні | 1,53 мг/кг в/о |
| 9. | Ацетат свинцю на фіз. р-ні + глутаргін | 1,53 мг/кг в/о 100 мг/кг з їжею |
| 10. | Ацетат свинцю на фіз. р-ні + водний р-н екстракту S. coronata | 1,53 мг/кг в/о 20 мг/кг з їжею |
Примітка: в/о – внутрішньоочеревинний шлях введення, фіз. р-н – фізіологічний розчин.
Після припинення експозиції половину тварин знеживлювали шляхом декапітації та проводили дослідження, а решту утримували в умовах віварію 1 місяць, після чого теж знеживлювали. Після декапітації забирали кров та одразу видаляли внутрішні органи.
Концентрацію свинцю у біологічних середовищах щурів визначали методом атомно-абсорбційної спектрофотометрії в полум’ї.
Дослідження кількості еритроцитів та гемоглобіну проводили фотоколориметричним методом, розрахунок лейкоцитарної формули, кількості ретикулоцитів, еритроцитів з базофільною зернистістю здійснювали по загальноприйнятій методиці. Визначення стійкості еритроцитів до кислотного гемолізу проводили кінетичним методом.
Біохімічні дослідження, що характеризують стан окисного метаболізму та обмін оксиду азоту, проводили у плазмі, еритроцитарному концентраті, гомогенатах тканин печінки і аорти.
Рівень загальних вмісту тіолових сполук в гомогенаті печінки оцінювали з реактивом Елмана (Ellman G.I., 1959), рівень небілкових (низькомолекулярних) тіолів визначали після осадження трихлороцтовою кислотою. Вміст пероксиду водню (Н2О2) визначали спектрофотометрично після додавання аліквоти проб до розчину йодиду калію (0,1 моль) із надлишком лактопероксидази (50 нмоль) у фосфатному буфері (0,05 моль) при довжині хвилі 353 нм (Huwiler M., 1984). Рівень генерації супероксид-аніону у пробах оцінювали по зміні екстинції при 550 нм за окисленням цитохрому С у 10 ммоль тріс-буфері після інкубації сумішей при 37 °С протягом 30 хв (Mc. Cord J., 1982). Визначення рівнів генерації ОН-радикалу проводили в інкубаційній суміші по приросту малонового діальдегіду (Conte D., 1996).
Активність сумарної NOS визначали за вмістом новоутвореного нітрит-аніону колориметричним методом (Vodovotz Y., 1994; Green L.C., 1982). Інкубаційна суміш складалась з 50 ммоль фосфатного буфера (рН 7,4), 1,25 ммоль CaCl2, 1 ммоль NADPH, 1 ммоль L-аргініну. Для визначення іNOS в інкубаційну суміш замість CaCl2 додавали 0,1 ммоль ЕДТА. Розрахунок активності сNOS проводили шляхом віднімання від показника активності сумарної NOS показник активності іNOS. Вміст нітрит-аніону (NO2-‾) визначали в безбілкових аліквотах гомогенатів чи надосадових проб після визначення активності NO-синтази у колориметричній реакції за допомогою реактиву Гріса методом Гріна (Green L.C., 1982). Вміст нітрат-аніону (NO3‾) визначали спектрофотометричним методом (Isukahara H., 1996) у модифікації з бруцином. Концентрацію низькомолекулярних нітрозотіолів (НМНТ) визначали в безбілковій кислоторозчинній фракції за методикою визначення NO2- з модифікованим реактивом Гріса, що містив катіони Нg2+ (2,5 % Hg2+ в 4 % розчині Н3РО4) (Padgett C. M., 1998). Визначення високомолекулярних нітрозотіолів (ВМНТ) проводили за методикою визначення NO2- в білкових аліквотах після гідролізу проб протягом 18 годин при кімнатній температурі у присутності катіонів Нg2+ (Padgett C. M., 1998). Визначення нітратредуктазної активності проводили за змінами вмісту субстрату субстрату – нітрат-анону- в натрій-фосфатному (20 ммоль/л рН 7,4) в присутності надлишку NADH (Li H., 2001). Активність аргінази визначали спектрофотометричним методом за вмістом сечовини (Garganta C. L., 1982). Концентрацію сечовини оцінювали в безбілкових пробах колориметричним методом з набором реактивів фірми LAСHEMA. Вміст загального білку в пробах визначали загальновідомим методом Бредфорд.
Дослідження скоротливої функції аорти проводили на препаратах ізольованих сегментів грудного відділу аорти експериментальних тварин (щурів) (Соловйов А.І., 2000; Ткаченко М.М., 2002). Після видалення аорту нарізали на сегменти шириною близько 1,5 – 2 мм (маса близько 2 мг) під кутом 45° із урахуванням циркулярної орієнтації гладком’язевого шару. Препарат ізольованого сегменту аорти поміщали в проточну термостатовану (36° С) камеру в стандартний розчин Кребса (NaCl – 133,0; KCl – 4,7; NaHCO3 – 16,3; NaH2PO4 – 1,38; CaCl2 – 2,5; MgCl2 – 1,05; глюкоза – 7,8 ммоль/л; рН 7,4), де його піддавали розтягненню з силою 10 мН і витримували протягом 30-40 хв. Скорочувальну активність гладеньких м’язів (ГМ) аорти реєстрували за допомогою механоелектричного перетворювача 6МХ1С в режимі, що наближався до ізометричного. Активацію ГМ проводили додаванням до буферного розчину норадреналіну (НА, “Sigma”, США). Ендотелійзалежні та ендотелійнезалежні реакції досліджували по зміні тонічного напруження ГМ на ендотелійзалежний агоніст мускаринових рецепторів ацетилхолін гідрохлорид (“Flьka”, Швейцарія) та ендотелійнезалежний агоніст нітропрусид натрію (“Sigma”, США). Зміну амплітуди тонічного напруження вимірювали у відсотках відносно до їх сталого скорочення на НА (скорочення на НА приймали за 100%).