Эволюция энергетических процессов у эубактерий (стр. 10 из 13)

CH₂NH₂-COOH	+	НАД-H₂	®	CH₃-COOH	+	NH₃	+	НАД⁺.
глицин	ацетат

В целом сопряженные окислительно-восстановительные превращения аланина и глицина могут быть выражены следующим образом:

аланин + 2H₂O ® ацетат + NH₃ + CO₂ + 4Н;

2 глицин + 4Н ® 2 ацетат + 2NH₃.

Получение энергии при сбраживании этой пары аминокислот связано с окислением аланина и соответствует 1 молекуле АТФ на молекулу окисленного аланина.

Обнаружены клостридии, специфически приспособленные к сбраживанию гетероциклических азотсодержащих соединений" в том числе пуринов и пиримидинов, — пуринолитические клостридии. Относящиеся к этой группе виды часто узкоспециализированы в отношении пищевых субстратов. Так, C. acidurici и C. cylindrosporum могут расти, сбраживая только некоторые пурины (гуанин, ксантин, гипоксантин, мочевая кислота) до уксусной и муравьиной кислот, глицина, NH₃ и CO₂. C. uracilium и C. oroticum могут сбраживать пиримидины. C. oroticum использует оротовую кислоту, выделяя в среду уксусную и дикарбоновую кислоты, CO₂ и NH₃. C. uracilium использует урацил, который распадается до b-аланина, CO₂ и NH₃. Сбраживание пуринов и пиримидинов — сложный процесс, состоящий из многих последовательных реакций, в некоторых из них путем субстратного фосфорилирования синтезируется АТФ.

Совершенно особый тип брожения осуществляет C. kluyveri, сбраживающий смесь этанола и уксусной кислоты до масляной, капроновой кислот и H₂. Превращение этанола и уксусной кислоты в масляную и капроновую кислоты можно описать. следующими уравнениями:

Однако ни одна из этих реакций не приводит к синтезу АТФ. Энергетическая сторона процесса долгое время оставалась неясной. Оказалось, что получение энергии связано с образованием молекулярного водорода в процессе окисления этанола, дегидрирование которого на двух этапах приводит к синтезу ацетил-КоА:

Электроны с ферредоксина могут переноситься далее на НАД⁺ или на Н⁺, что приводит в последнем случае к выделению H₂. Следствием переноса части электронов на H⁺ будет нарушение соотношения между количеством ацетил-КоА и НАД-H₂, необходимым для синтеза масляной кислоты (см. рис. 57), в сторону относительного недостатка молекул восстановленного кофермента. Возникшие "избыточные" молекулы ацетил-КоА используются для синтеза АТФ в реакциях, описанных ранее. По проведенным подсчетам, энергетический выход этого вида брожения составляет около 1 моля АТФ на 6 молей этанола.

Таким образом, типы брожений, осуществляемых клостридиями, необычайно разнообразны как в отношении используемых субстратов, так и синтезируемых конечных продуктов, и виды, осуществляющие сбраживание углеводов по гликолитическому пути с накоплением масляной кислоты в качестве одного из основных продуктов, являются только одной из групп организмов, относимых к роду Clostridium.

Особенности конструктивного метаболизма

Потребности клостридиев в питательных веществах отличаются большим разнообразием. Как правило, клостридии могут расти только на сложных, богатых органическими соединениями средах. Многие клостридии выделяют экзоферменты, расщепляющие макромолекулы (углеводы, белки) на составляющие их мономеры. До сих пор только небольшое число видов удалось культивировать в лаборатории на синтетической среде. Для них выявлена потребность в витаминах (главным образом группы В) и наборе аминокислот.

Интересная особенность эубактерий из рода Clostridium — дальнейшее развитие способности вовлекать углекислоту в клеточный метаболизм. У C. kluyveri, растущего на смеси C₃-соединений (этанол + ацетат), до 30% углерода клетки возникает из углерода CO₂. Для C. aceticum и других видов, осуществляющих гомоацетатное брожение, показана способность к хемолитоавтотрофному росту на минеральной среде за счет превращения CO₂ и H₂ в ацетат:

4H₂ + 2CO₂® CH₃-COOH + 2H₂O.

В группу гомоацетатных бактерий, помимо некоторых представителей рода Clostridium, входят организмы, принадлежащие к родам Acetobacterium, Acetogenium, Eubacterium, Butyribacterium и др. При росте на минеральной среде энергию ацетогены получают в процессе анаэробного дыхания с использованием H₂ в качестве донора электронов, а CO₂ — конечного их акцептора (см. гл. 16). Исходными метаболитами для биосинтетических путей служат ацетил-КоА (ключевой метаболит пути фиксации CO₂ ацетогенами) и пируват, образующийся из последнего в реакции восстановительного карбоксилирования.

Пути включения CO₂ в клеточный метаболизм клостридиев различны. Углекислота может использоваться ими в качестве конечного акцептора электронов, что приводит к прямому восстановлению CO₂ до формиата. Донорами электронов в этой реакции служат восстановленный ферредоксин или НАД-H₂. Реакция может служить способом удаления избытка восстановительных эквивалентов, образующихся при брожении, т. е. быть необходимой для сбалансирования окислительных и восстановительных этапов в энергетическом метаболизме. Образовавшийся в результате восстановления CO₂ формиат может подвергаться дальнейшему восстановлению и служить источником метильных групп, используемых для клеточных биосинтезов.

Для разных видов клостридиев показана активная фиксация CO₂ на C₂- и C₃-соединениях, таких как ацетил-КоА, пропионил-КоА, пируват, в реакциях восстановительного карбоксилирования, например:

ацетил-КоА+ CO₂ + Фд_восст® пируват + KoA-SH + Фд_ок.

Механизм, по которому происходит автотрофная фиксация CO₂ у клостридиев, осуществляющих гомоацетатное брожение, изображен на рис. 62.

Дальнейший шаг вперед по пути независимости от среды связан с распространением у этой группы эубактерий способности фиксировать атмосферный азот (небольшая способность к фиксации N₂ обнаружена у пропионовых бактерий). Первый анаэробный азотфиксатор был выделен из почвы C. Н. Виноградским и назван им в честь Л. Пастера Clostridium pasteurianum.

Молекула N₂ чрезвычайно прочна. Чтобы разорвать три связи между двумя атомами в молекуле N₂, необходимо затратить 941 кДж/моль, поэтому восстановление N₂ до NH₃ химическим путем — очень энергоемкий процесс. Фиксация молекулярного азота, до сих пор обнаруженная только у прокариот, осуществляется с помощью ферментной системы — нитрогеназы, состоящей из двух компонентов: малого, содержащего железо и серу (Fe-белок), и большого, в состав которого дополнительно входит молибден (MoFe-белок)⁴⁷. Соотношение между ними у разных азотфиксирующих прокариот колеблется от 1:1 до 2:1, хотя в целом нитрогеназы из разных источников обнаруживают значительное сходство.

Для функционирования нитрогеназы необходим источник энергии в виде АТФ, ионы магния и восстановитель с низким окислительно-восстановительным потенциалом. У C. pasteurianum непосредственным донором электронов для восстановления N₂ служит восстановленный ферредоксин, электроны с которого поступают сначала на Fe-белок нитрогеназы (рис. 63).

⁴⁷ У некоторых азотфиксаторов вместо или наряду с молибденом в составе большой субъединицы обнаружен ванадий, у других найдена нитрогеназа, содержащая только железо.

Восстановленный Fe-белок образует комплекс с молекулами Mg и АТФ, что приводит к сдвигу окислительно-восстановительного потенциала FeS-центра белка от — 290 до — 400 мВ.

Это делает возможным последующий перенос активированных электронов на MoFe-белок, в активном центре которого происходит восстановление N₂. Перенос 1 электрона на MoFe-белок сопровождается гидролизом как минимум 2 молекул АТФ. Так как за один раз FeS-центрами ферредоксина, Fe- и MoFe-белков может быть перенесено не более 2 электронов, а для восстановления N₂ до аммиака необходимо 6 электронов, следовательно, процесс должен состоять не меньше чем из трех последовательных стадий восстановления:

Рис. 63. Функционирование нитрогеназы: кружком обозначена восстановленная форма белка. Объяснение см. в тексте

В течение длительного времени не удавалось обнаружить какие-либо частично восстановленные промежуточные соединения. Единственным идентифицированным продуктом восстановления был аммиак. Недавно быстрая остановка нитрогеназной реакции в кислой или щелочной среде позволила обнаружить гидразин. Вероятно, промежуточные соединения в процессе восстановления молекулы N₂ остаются прочно связанными с нитрогеназой. По проведенным измерениям, для восстановления 1 молекулы N₂ требуется не менее 12 молекул АТФ. Таким образом, процесс азотфиксации связан с затратой большого количества клеточной энергии. Для ассимиляции 1 мг N₂C. pasteurianum в процессе брожения перерабатывается примерно 500 мг сахара.

Помимо N₂ нитрогеназа может восстанавливать ряд других субстратов, таких как N₂O, C₂H₂ и его аналоги, N₃^–, CN^–. В отсутствие N₂ нитрогеназа катализирует выделение молекулярного водорода в реакции, протекающей с затратой АТФ. Это дает основание предполагать, что нитрогеназа является результатом дальнейшего усложнения молекулы гидрогеназы, приобретшей способность катализировать не только восстановление протонов, ведущее к выделению H₂, но и ряд других субстратов, в том числе и N₂.