Незримое одеяние голых тварей (стр. 2 из 2)
Xenopus laevis, не дававшие реакции с нитросиним тетразолием, тем не менее, обладали хемилюминесценцией [7]. Это навело нас на мысль, что они генерируют не супероксид, а перекись водорода. Наше предположение косвенно подтвердилось: группа бразильских ученых обнаружила, что жабрами взрослой пресноводной рыбы пецилии секретируется именно Н2O2 [9].
Исследование механизмов обнаруженного нами явления требовало дополнительных усилий. Решено было испытать, как действуют на продукцию АФК наружными поверхностями животных агенты, которые стимулируют или подавляют синтез этих форм белыми кровяными тельцами. Теперь опыты проводились специально на наиболее примитивных из уже исследованных нами животных, т.е. на губках Sycon sp. и актиниях Aiptasia pulchella. Выявляли генерацию АФК все тем же методом - хемилюминесценцией.
Чтобы вызвать продукцию АФК макрофагами или нейтрофилами, часто применяются вещества, которые стимулируют протеинкиназу С (фермент, активирующий NADPH-оксидазу за счет фосфорилирования), повышают проницаемость клеточной мембраны для ионов Са2+ (ионофоров) или вызывают фагоцитоз. Мы использовали вещества всех трех направлений действия. В качестве стимулятора протеинкиназы С применили форбол-12-миристат-13-ацетат (ФМА), а ионофором Са2+ нам служил иономицин. Оба эти вещества вызывали взрыв хемилюминесценции [7, 10]. Зимозан (фрагменты сухих клеточных стенок дрожжей), которым мы стимулировали фагоцитоз, усиливал хемилюминесценцию только губок, но не актиний [10]. Следовательно, лишь у губок продукция АФК наружной поверхностью связана с фагоцитозом.
Реакция актиний на иономицин и ФМА была связана, вероятнее всего, с NADPH-оксидазой в их амебоцитах (клетках между экто- и энтодермой), на так называемых мезентериальных нитях, выполняющих ту же роль, что и наши макрофаги и нейтрофилы. Зимозан, в отличие от ФМА и иономицина, не проникал через наружные покровы актиний, поэтому не оказывал на них влияния.
В качестве ингибиторов NADPH-оксидазы и миелопероксидазы мы избрали азид натрия NaN3 и ацетованиллон. Азид натрия подавляет активность всех ферментов, содержащих гем (комплексное соединение порфирина). К ним относятся и ферменты белых кровяных телец, образующие АФК. Ацетованиллон - это специфический ингибитор NADPH-оксидазы. В экспериментах азид натрия подавлял хемилюминесценцию и губок, и актиний, а ацетованиллон гасил свечение губок (на актиниях опыты не проводились) [7, 10].
Влияние зимозана (0.2 мг/мл), стимулятора фагоцитоза, на хемилюминесценцию губки Sycon sp.
Изменение хемилюминесценции актинии Aiptasia pulchella после добавления азида натрия (1 мМ) - ингибитора гемсодержащих ферментов.
Полученные результаты позволили нам предположить, что по крайней мере механизмы генерации активных форм кислорода наружной поверхностью губок и белыми кровяными тельцами сходны. Каким образом организовано производство АФК актиний, оставалось до конца не понятным. Чтобы все-таки выяснить это, мы решили идентифицировать ферменты, образующие АФК, непосредственно измеряя их активность. Так как у актиний генерация супероксида наружной поверхностью не была подтверждена методом ЭПР, мы решили, что скорее всего это не NADPH-оксидаза. “Подозрение”, таким образом, пало на миелопероксидазу и двойную оксидазу.
Первый фермент проявляет две активности: пероксидазную (способность окислять разные субстраты с помощью Н2O2) и хлорирующую. В измельченных тканях (гомогенатах) актиний нам удалось обнаружить только первую. Следовательно, мы имели дело с некой пероксидазой, не имеющей хлорирующей активности. Мы склоняемся к тому, что это может быть двойная оксидаза [10].
Поскольку ксантиноксидаза - тоже кальций-зависимый фермент [1] и теоретически могла бы активироваться иономицином, мы решили выяснить ее причастность к генерации АФК у актиний и губок. Ни у тех, ни у других мы не обнаружили ксантиноксидазную активность; по крайней мере, используемый нами метод не выявил каких-либо ее следов [10].
Теперь необходимо было убедиться в том, что генерация АФК морскими беспозвоночными представляет собой активный процесс, а не пассивную утечку вследствие слабой активности каталазы, как происходит у пресноводной рыбы пецилии [9]. Поэтому мы измеряли активности основных антиоксидантных ферментов - супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы в гомогенатах актиний и губок. Подобно нейтрофилам и макрофагам, эти животные обладают антиоксидантными ферментами, которые защищают их от повреждающего действия АФК. Однако с генерированием АФК наружными поверхностями актиний и губок такая защита не сбалансирована. У этих беспозвоночных животных активности таких ферментов довольно высоки в сравнении с теми, которые характерны для “профессионально” генерирующих АФК клеток млекопитающего - макрофагов и нейтрофилов морской свинки. Следовательно, можно было исключить пассивную утечку АФК в качестве единственного способа их удаления (таблица) [10].
Итак, механизмы генерации активных форм кислорода наружными поверхностями водных организмов в принципе те же, что слизистыми оболочками, клетками крови, лимфой и спермой высших животных, в том числе человека. Сходство механизмов позволяет предполагать и сходство функций: вероятно, оболочка из кислородных радикалов и Н2O2 защищает “голых” обитателей водоемов от патогенных микроорганизмов. Обладатели же кутикулы, раковины, наружного скелета или ороговевающего эпидермиса не нуждаются в дополнительной защите наружной поверхности посредством АФК. У таких организмов эти формы служат лишь для поддержания постоянного состава внутренней среды (гомеостаза) и для защиты открытых участков тела, непосредственно граничащих с внешней средой (например, жабр у пецилии [9]).
Голые твари, одетые в незримую “одежду” из АФК, могут приносить пользу не только самим себе, но и всему водному биоценозу в целом: генерируемые ими активные формы кислорода освежают воду, препятствуя развитию гнилостной микрофлоры. Для нее, возможно, АФК служат неким “опознавательным знаком”, позволяющим отличать живые организмы от мертвых и не поедать живых - иначе она рисковала бы остаться в конце концов без питания.
Вероятно, такие отношения между животными и бактериями-сапрофитами, которые расплодились в изобиловавшем органическими остатками теплом первичном океане, сложились еще на заре эволюции органического мира, в докембрии. Для большинства животных, по-видимому, этот способ оказался слишком энергоемким (возможно, из-за повышения концентрации растворенного в океанической воде кислорода - продукта оксигенного фотосинтеза древних синезеленых водорослей), и они “прикрыли” свою поверхность осязаемым наружным скелетом из хитина, известняка или целлюлозы. Результатом этого стала так называемая “кембрийская скелетная революция”. До нее же, как известно, все найденные в ископаемом виде животные были голыми. Для тех, кто дерзнул после этой “революции” остаться нагим, вырабатываемые всей поверхностью тела АФК служили и служат невидимым покровом, защищающим от болезнетворных и гнилостных бактерий.
Влияние апоцинина (25 мкМ) на хемилюминесценцию губки Sycon sp.
Этот селективный ингибитор NADPH-оксидазы быстро гасит свечение губки.
В процессе эволюции анатомия живых организмов усложнялась. В слабо упорядоченных сгустках клеток, каковые фактически представляют собой губки, дифференцировались вначале настоящие ткани, затем - органы. Возникали приспособления, позволяющие выходить из водной среды на сушу. Но принципы организации неспецифической защиты организма оставались прежними: участки тела, непосредственно граничащие с внешней средой и не имеющие плотных покровов, оказались защищены невидимым облаком из АФК. У высших позвоночных и человека это желудочно-кишечный тракт, дыхательные пути, гениталии, т.е. органы, которые открыты для внешней среды, но как бы “ввернуты” внутрь тела. Об их защите природа позаботилась, снабдив их способностью генерировать АФК в нужный момент и в необходимом количестве. Интересно, что и нервная ткань, некогда в ходе эволюции граничившая с внешней средой, но у высших организмов “провалившаяся” внутрь тела по ходу индивидуального развития, также сохранила способность к генерации АФК. Так что невидимое одеяние, защищавшее в глубокой древности голых обитателей океана, у одних организмов сохранилось в том же виде и поныне, у других - только в отдельных тканях и органах.
Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований. Проект 05-04-49316.
Список литературы
1. Гордеева А.В., Звягильская Р.А., Лабас Ю.А. // Биохимия. 2003. Т.68. №10. С.1318-1322.
2. Geiszt M. // Cardiovasc. Res. 2006. V.71. №2. P.289-299.
3. Arnold J. // Биохимия. 2004. Т.69. №1. С.8-15.
4. Ris-Stalpers C. // Antioxid Redox Signal. 2006. V.8. №9-10. P.1563-1572.
5. Park J. -B. // Exp. Mol. Med. 2003. V.35. №5. P.325-335.
6. Лабас Ю.А., Гордеева А.В. Как возникла биолюминесценция? // Материалы международной конференции “Водные экосистемы и организмы - 4”.Ред. В.Д.Федоров, С.А.Остроумов. М., 2003. С.76-80.
7. Гордеева А.В., Лабас Ю.А. // Цитология. 2003. Т.45. №3. С.284-289.
8. Peskin A.V., Labas Y.A., Tikhonov A.N. // FEBS Lett. 1998. V.434. №1-2. P.201-204.
9. Wilhelm-Filho D., Gonzalez-Flecha B., Boveris A. // Braz. J. Med. Biol. Res. 1994. V.27. №12. P.2879-2882.
10. Гордеева А.В., Наглер Л.Г., Лабас Ю.А. // Журн. эволюционной биохимии и физиологии. 2006. Т.42. №3. С.201-207.