Промышленные процессы с использованием иммобилизованных ферментов и клеток
Получение глюкозофруктозных сиропов.
Первая промышленная установка для превращения глюкозы во фруктозу с помощью иммобилизованной глюкоизомеразы была запущена лишь в 1973 г. Исходным сырьем для этого процесса служит глюкоза, которую получают при гидролизе кукурузного или картофельного крахмала в присутствии минеральных кислот. Для конструирования промышленного биокатализатора глюкоизомеразу сорбируют на пористых неорганических носителях или ионообменных смолах. Возникающий в результате каталитического процесса глюкозофруктозный сироп содержит 42–45% фруктозы, около 51% глюкозы, небольшое количество олигосахаридов и по сладости соответствует инвертному сахару, получаемому при гидролизе сахарозы.
Получение L-аминокислот из их рацемических смесей.
Наряду с микробиологическими способами важное значение имеют химические методы промышленного получения природных аминокислот, в том числе незаменимых. Однако в результате химических реакций, используемых для синтеза аминокислот, содержащих асимметрические атомы углерода, с одинаковой скоростью образуются как D-, так и L-стереоизомеры, т.е. всегда возникает рацемическая смесь. Разделение рацемических смесей на составляющие их оптические изомеры (представляющее труднейшую задачу) явилось первым промышленным процессом с использованием иммобилизованных ферментов. Этот процесс был осуществлен в Японии в 1969 г.с помощью аминоацилазы, иммобилизованной на ДЕАЕ-целлюлозе. В качестве исходных соединений в данном превращении используют N-ацилированные производные D-, L – аминокислот, получаемые с помощью химического синтеза. Аминоацилаза гидролизует лишь N-ацил-L-стереоизомер, отщепляя от него ацильный радикал, в результате чего растворимость образующейся L-аминокислоты резко возрастает и ее легко можно отделить от своего антипода физико-химическими методами. При нагревании оставшаяся N-ацил-D-аминокислота рацемизируется, т.е. превращается в исходную смесь, которая вновь подвергается воздействию фермента.
Аминоацилаза строго специфична к структуре только ацильной части субстрата, поэтому одна и та же установка с иммобилизованным ферментом используется для получения различных аминокислот.
Получение L-аспарагиновой кислоты.
Аспарагиновая кислота широко употребляется в качестве пищевой добавки (подсластитель и подкислитель). Первая в мире промышленная установка для синтеза L-аспарагиновой кислоты из получаемого химическим путем фумарата аммония была запущена в 1973 г. в Японии. В ней использованы иммобилизованные в полиакриламидном геле клетки кишечной палочки E.coli, содержащие аспартат-аммиак-лиазу.
H4NOOC-CH=CH-COOH = HOOC-CH2-CH(NH2) – COOH
Получение L-аланина.
В настоящее время основной промышленный способ получения L-аланина – ферментативное декарбоксилирование L-аспарагиновой кислоты. Процесс превращения L-аспартата в L-аланин катализируется аспартат-β-декарбоксилазой ряда микроорганизмов (Pseudomonas dacunhae, Alcaligenes faecalis, Achromobacter pestifier), иммобилизованных в полиакриламидном геле.
HOOC-CH2-CH(NH2) – COOH = CH3-CH(NH2) – COOH+CO2
Усовершенствование процесса связано с использованием в качестве сырья фумарата аммония. В данном случае процесс получения L-аланина становится двустадийным и реализуется в двух последовательно расположенных колонках. На первом этапе фумарат аммония превращается в L-аспарагиновую кислоту, которая без выделения из реакционной среды на втором этапе претерпевает β-декарбоксилирование с образованием аланина.
Получение L-лизина
Процесс получения лизина основан на стереоспецефическом ферментативном гидролизе (конверсии) D-, L-α-амино-ε-капрлактама, который сначала получают химическим путём из циклогексена. Рацемат используют в качестве субстрата, который под действием лактамазы превращается в L-лизин, а непрореагировавшая D-форма переводится в смесь антиподов рацемазой. Лактамаза найдена у некоторых дрожжей (Candida laurentil). Рацемаза обнаружена у ряда бактерий (Alkaligenes obae).
Получение триптофана
Химико-ферментативный способ получения триптофана состоит в прямой конденсации индола, аммиака и ПВК. Реакцию катализирует пиридоксальзависимая триптофаназа. Фермент найден у E.coli.
Получение L-яблочной кислоты.
Яблочная кислота – заменитель лимонной в продуктах питания и лекарственных препаратах. Яблочную кислоту получают, используя иммобилизованные в полиакриламидном геле клетки, содержащие фумаратгидратазу. В присутствии этого фермента происходит присоединение воды по двойной связи в молекуле фумаровой кислоты.
HOOC-CH=CH-COOH+H2O = HOOC-CH(OH) – CH2-COOH
Перспективы технологии иммобилизованных ферментов[4]
Сегодня в промышленности реализовано всего четыре крупномасштабные технологии на основе иммобилизованных ферментов (глюкоизомеразы, аминоацилазы, пенициллазы и лактазы). В обозримом будущем иммобилизованные ферменты могут быть использованы для следующих целей.
1. Холинэстераза может применяться для определения пестицидов. Степень ингибирования этого фермента в присутствии пестицидов оценивают электрохимическими или колориметрическими методами.
2. Иммобилизованная диизопропилфторфосфатаза нервных клеток кальмара может найти применение для обезвреживания фосфорорганических нервных газов.
3. Иммобилизованная гепариназа может применяться для предотвращения тромбообразования в аппаратах искусственного кровообращения.
4. Предложен новый способ применения иммобилизованного гемоглобина. Включённый в полиуретановую матрицу белок образует «гемогубку», способную поглощать кислород прямо из воды с эффективностью 80%. Далее кислород высвобождается из полимера под действием слабого электрического разряда. Предполагается, что такая система может снабжать кислородом водолазов либо работающие под водой двигатели.
5. Возможно, вскоре удастся создать системы из нескольких иммобилизованных ферментов. Так, если заключить в микрокапсулы уреазу, глутаматдегидрогеназу и глюкозодегидрогеназу, то их можно будет использовать для удаления мочевины из крови больных с почечной недостаточностью.
6. Разнообразные иммобилизованные ферменты находят применение в датчиках быстрого анализа.
7. В последнее время большое внимание уделяется использованию различных микробных оксигеназных систем в стереоспецефическом эпоксиокислении олефинов.
1.5 Основы получения метаболитов
Процессами биотрансформации называют реакции превращения исходных органических соединений (предшественников) в целевой продукт с помощью клеток живых организмов или ферментов, выделенных из них.
По отношению к процессу роста низкомолекулярные продукты метаболизма живых клеток делятся на первичные и вторичные метаболиты. Первичные метаболиты необходимы для роста клеток. К ним относятся структурные единицы биополимеров – аминокислоты, нуклеотиды, моносахариды, а также витамины, коферменты, органические кислоты и другие соединения. Вторичные метаболиты (антибиотики, пигменты, токсины) – низкомолекулярные соединения, не требующиеся для выживания клеток и образующиеся по завершении фазы их роста.
Механизмы интенсификации процессов получения продуктов клеточного метаболизма
В норме обмен веществ в клетке осуществляется по принципам строжайшей экономии, что обеспечивается сложнейшей системой регуляции обмена веществ. Задача биотехнолога состоит в обеспечении сверхсинтеза одного из продуктов метаболизма, что достигается как путем изменения генетической программы организма, так и посредством нарушения регуляторных систем метаболизма в нем[7].
Для выделения из природных популяций высокопродуктивных штаммов микроорганизмов используют методы селекции, т.е. направленного отбора организмов со скачкообразным изменением геномов. Для возникновения мутаций интересующий ген должен удвоиться 106-108 раз. Более эффективен метод искусственного повреждения генома. Таким методом является индуцированный мутагенез, основанный на использовании мутагенного действия ряда химических соединений, рентгеновских и ультрафиолетовых лучей.
Координация химических превращений, обеспечивающая экономность метаболизма, осуществляется у микроорганизмов тремя основными механизмами: регуляцией активности ферментов, в том числе путем ретроингибирования; регуляцией объема синтеза ферментов (индукция и репрессия биосинтеза ферментов); катаболитной репрессией.
В процессе ретроингибирования (ингибирование по принципу обратной связи) активность фермента, стоящего в начале многоступенчатого превращения субстрата, тормозится конечным метаболитом, что детально разработано при изучении регуляции биосинтеза пиримидиновых нуклеотидов и новообразования ряда аминокислот.
На обмен веществ, аналогичный конечным метаболитам, оказывают эффект их аналоги. Для отбора объектов продуценты выращивают на селективной среде, содержащей подходящий аналог или антиметаболит, которые не включаются в обмен веществ (в частности, аналоги аминокислот не включаются в состав белков), что ведет к подавлению роста организма. Выжившие мутанты обладают дефектами в механизме регуляции активности фермента по принципу обратной связи и поэтому служат важными объектами в обеспечении сверхсинтеза целевого продукта.
Так, мутации по участкам цистрона, детерминирующим структуру аллостерического центра фермента, могут привести к изменениям в конформации белка, которые делают молекулу энзима нечувствительной к концентрации конечного продукта. Это обеспечивает возможность образования в клетке избыточного количества целевого продукта.