Изучение свойств бактериальной суспензии и ее применение в подготовительных процессах переработки мехового сырья (стр. 8 из 15)
Все культуры имеют точечные круглые колонии грязно–белого цвета, непрозрачные, матовые, с ровными краями, структура колоний однородная, профиль выпуклый.
Для изучения подвижности микроорганизмов была рассмотрена раздавленная капля бактериальной суспензии (п.2.2.6), в результате чего отмечено хаотичное движение бактерий, обусловленное перетрихиальным расположением жгутиков.
Ферментативная способность выделенных культур была определена на основе исследований протеолитической активности (п. 2.2.9), редуцирующей способности (п.2.2.13), анализа на индолообразование (п. 2.2.10), наличие сероводорода (п. 2.2.11), аммиака (п. 2.2.12), каталазы (п.2.2.14).
Результаты исследований, представленные в таблице 2, показали положительную реакцию для всех культур на наличие аммиака, на сероводород и каталазу - отрицательные. Изучение протеолитической активности показало, что все культуры растут без разжижения желатина, не выделяют индол и не обладают редуцирующей способностью, что свидетельствует о низких протеолитических свойствах исследуемых микроорганизмов.
Для изучения биохимической активности бактерий были проведены тесты на способность микробов к ферментативному расщеплению сахаров. В качестве субстратов, для определения ферментативной активности использовались такие сахара, как мальтоза, галактоза, глюкоза, сахароза. Расщепление может происходить на альдегиды, газообразные продукты, кислоты для этого был произведен посев культур на специальные среды с углеводами (п.2.2.15).
На жидкие среды, содержащие различные сахара, был произведен посев по 0,1 см3 суспензии клеток и термостатирование в течение 48 ч при температуре (37±0,5)˚С. Наблюдения показали, что уже к 24 ч окраска сред изменилась от желтой до ярко малиновой и изменение рН.
Для определения липолитической активности был произведен посев на бульон Штерна (п.2.2.16), содержащего в качестве субстрата глицерин. Посев производили следующим образом для получения биомассы исследуемой культуры микроорганизмов, производили посев на скошенную синтетическую среду и культивировали в течение 24 часов при температуре, затем производили смыв полученной биомассы 10 см3 бульона Штерна, и термостатировали при температуре (37±0,5)˚С в течение 96 часов.
На протяжении от 24 до 96 часов культивирования наблюдалось изменение окраски среды, помутнение, наличие пузырьков у поверхности среды, образование осадка и пленки. Уже к 24 часам культивирования было отмечено розовение окраски для всех сред, зараженных культурами. К 48 ч характерно образование пристеночного кольца на поверхности жидкости интенсивной розовой окраски. К 72 ч наблюдалось полное обесцвечивание растворов.
На основании проведенных исследований следует отметить, что исследуемые культуры микроорганизмов обладают липолитической активностью, что связано с вовлечением нерпичьего жира (в качестве источника углерода) в конструктивный и энергетический обмен, что подтверждается переходом окраски бульона из оранжевой в красную и изменением активной реакции среды.
3.2 Изучение деструкции жиров методом потенциометрического титрования
Метод основан на исследовании взаимодействия веществ с протонами потенциометрическим титрованием.
Кривые титрования позволяют:
- определить природу и число ионогенных групп в молекуле жира
- изучить влияние добавок щелочей на ионизацию эфирных групп жира
- оценить глубину и специфичность реакций жиров с микроорганизмами
- количественно определить деструкцию жиров.
Кривые титрования показывают зависимость числа связанных протонов омыленными жирами от рН среды. Величина рН измеряется непосредственно на приборе, число связанных протонов вычисляется. Число связанных ионов определяется по разности между общим числом добавленных ионов и числом свободных ионов в растворе.
Для изучения деструкции были выбраны следующие жиры: нерпичий, сульфатированный рыбий, шерстный, свиной и Tanning oil. Навеску жира, около 1г, взвешенную на аналитических весах, помещали в коническую колбу, в которой проводили щелочной гидролиз (п. 2.2.23), количественно переносили в мерную колбу на 250 см3 и объем доводили до метки дистиллированной водой. Затем отбирали пробу разбавленного гидролизованного жира 4 см3, переносили в стакан на 50 см3 и добавляли 33 см3 дистиллированной воды, для того чтобы мембрана стеклянного электрода была погружена в раствор. Измерение проводили на приборе рН-метр «Анион 7051» путем фиксирования значений рН раствора при добавлении по 0,1 см3 0,1 н. раствора соляной кислоты. Параллельно проводили титрование раствора чистой щелочи (5 см3 30% раствора NaOH переносили в мерную колбу на 250 см3, доводили до метки дистиллированной водой, для анализа брали 4 см3 раствора) и воды. При титровании соли жирной кислоты раствором кислоты происходит реакция обмена с образованием кислоты и соли:
RCOONa + HCl → RCOOH + NaCl
При титровании происходит помутнение раствора в момент образования жирной кислоты.
Для построения кривой титрования проводили расчет параметров по следующим формулам:
B = (CН * V1)/(V1+V) * 1000, где (1)
B – объем HCl, который добавлен к 100 см3 воды
CН – нормальная концентрация кислоты
V1 – добавленный объем,см3
V – начальный объем раствора,см3
C = (- lg B) (2)
D – экспериментальное значение рН
Строим график зависимости C от экспериментальных значений рН (находим формулу по линии Тренда, для подстановки в W)
Для изучения деструкции жира микроорганизмами предварительно были приготовлены бактериальные суспензии в колбах Эрленмейера на основе жидкой синтетической среды (п.2.2.8), содержащей около 1 г жира, объемом 200 см3 каждая. Культивирование микроорганизмов проводили в термостате марки (ТС-80М-2) при температуре (37±5)°С, осуществляя переменное механическое воздействие, на встряхивателе «Shaker Type-357», с частотой колебаний 200 об/мин, амплитудой 6 по 1 ч в сутки в течение 48 часов. После чего проводили гидролиз содержимого колбы (п.2.2.23), переносили в мерную колбу на 250 см3, доводили объем до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивали. Затем отбирали объем пробы в количестве 4 см3 в стакан на 50 см3, добавляли 33 см3 дистиллированной воды. Титровали 0,1 н раствором соляной кислоты по 0,1 см3 на приборе рН-метр «Анион 7051» при температуре 20,6 ºС. При каждом объеме добавленной кислоты фиксировали значение рН и строили графики зависимости рН от объема и количество функциональных групп (N) от значений рН.
Пример расчета параметров для построения кривых титрования жира при добавлении 3 см3 кислоты (сульфатированный рыбий жир):
B = (0,1 * 3)/(3+33) * 1000 = 8,33
C = (- lg 8,33) =0,9208
D = 12,33 (экспериментальное значение рН)
F = 3мл (количество с известной концентрацией раствора реагента, добавленное к раствору жира, см3)
G = 0,057(объем HCl, который добавлен к водному раствору жира, см3)
H = (-lg G) = 1,243
Строим график зависимости lg B от экспериментальных значений рН для воды (находим формулу по линии Тренда, для подстановки в W)
Рисунок 3- Кривая титрования воды 0,1н раствором соляной кислоты
Находим значение W при подстановки значений H в формулу, полученную по линии Тренда, вместо Х
-0,1233Х+3,6351=-0,1233*1,243+3,6351=3, 658
W = 3,658
J = 12,33
K = W- J = 3,658-12,33 = -8,061
L = 8,67
M = 1
N = (0,057*1*10)/0,139 =4,1109
Остальные расчетные данные представлены в таблице 4
Для определения количества групп СООН строим графики в координатах количество функциональных групп – рН.
Рисунок 4- График зависимости количества карбоксильных групп от значений рН
Из рисунка 4 видно, что в диапазоне Рн 4,37 до 11,56 кривая представляет собой вид прямой при количестве функциональных групп равных 2. Поэтому данное значение принимаем равным 2.
Рисунок 5 - Кривая титрования раствора сульфатированного рыбьего жира соляной кислотой
Кривая титрования омыленного жира характеризуется нейтрализацией избытка щелочи, олеатов и пальмитинатов натрия. Первой вступает в реакцию соль более слабой кислоты, так как полнее идет ее гидролиз. После полного гидролиза соли слабой кислоты в реакцию вступает натриевая соль более сильной кислоты. В результате нейтрализации образуются жирные кислоты, нерастворимые в воде, что сопровождается помутнением раствора. Качественное соотношение жирных кислот в жирах определялось по положению скачка на кривой потенциометрического титрования.
На основании обработки кривых потенциометрического титрования было определено, что исследуемые жиры – нерпичий, свиной, сульфатированный рыбий, шерстный и Tanning oil G могут содержать преимущественно олеиновую пальмитиновую и изомер пальмитиновой кислот. Кроме того в них могут содержаться незначительные количества линолевых кислот, миристиновой, пальмитолеиновой, арахидоновой.
Соли жирных кислот с одинаковым числом углеродных атомов титруются в один скачок - пальмитиновая и пальмитолеиновая. На кривой титрования четко выражены скачки, соответствующие нейтрализации солей жирных кислот. Расчетные данные показали, что количество групп СООН может составлять от 1 до 3 в расчете ммоль на г жира.