Расхождение между параллельными определениями не должно превышать 0,3%.
Метод Блая и Дайера (нестандартный метод). Для более полного извлечения липидов из объекта используется смесь полярного и неполярного растворителей.
Навеску фарша массой 5 г (муки — 2 г), взвешенную с погрешностью не более 0,001 г, следует поместить в сосуд гомогенизатора. Туда же добавить хлороформ, метанол и дистиллированную воду. Наиболее полное извлечение липидов из тканей рыбы происходит при соотношении хлороформа, метанола и воды — соответственно —1:2: 0,8, с учетом воды, содержащейся в исследуемом образце (определяется предварительно).
Соотношение масс навески и экстракционной смеси должно быть 1 : 40. Обработку (перемешивание) массы в гомогенизаторе следует проводить в течение 1,5...2 мин при скорости 5000 об/мин. Полученный гомогенизат отфильтровать на воронке Бюхнера.
К фильтрату необходимо добавить хлороформ и дистиллированную воду в таком количестве, чтобы соотношение хлороформа, метанола и воды в смеси было соответственно 2:2:1,8. Для этого остаток, полученный на фильтре после фильтрования гомогенизатора, промыть такой же порцией хлороформа, которую брали для экстракции, деля ее на три части и предварительно промывая этим количеством сосуд гомогенизатора. Весь полученный фильтрат перенести в делительную воронку с притертой пробкой и добавить необходимое количество дистиллированной волы. После расслоения смеси на две фазы отделить нижний хлороформенный слой с растворенными в нем липидами и определить его количество, затем измерить его концентрацию. Для этого пипеткой отобрать 5 см3 мисцеллы. поместить в предварительно тарированную бюксу, удалить хлороформ (выпаривая его на водяной бане или оставляя мисцеллу в вытяжном шкафу при комнатной температуре) и высушить при температуре 100...105°С до постоянной массы (около 30 мин).
Содержание жира Х (в %) определяется по формуле:
x = (m1-m2)*v*100 / m*v1
где т2 — масса бюксы с жиром, г; m1 — масса пустой бюксы, г;v — объем полученной мисцеллы, см3; v1 — объем мисцеллы, взятый в бюксу для определения концентрации, см3; т — масса навески исследуемого вещества, г.
Расхождение между параллельными определениями не должно превышать 0,3%.
2.3 Методы определения азота
Существующие методы определения содержания азота в сырье, полуфабрикатах и готовой продукции можно разделить на две группы: методы, предусматривающие сжигание (минерализацию) навески исследуемого продукта; методы, не предусматривающие сжигание навески.
В анализах, проводимых в лабораториях береговых рыбообрабатывающих предприятий и судов, наиболее часто используются методы, относящиеся к первой группе. Некоторые из них достаточно быстрые. Снижение затрат времени на анализ достигается за счет рационального подбора количественного и видового состава основных реагентов и катализаторов, а также совмещения отдельных операций (например, минерализации, отгонки и улавливания аммиака) и изменения техники их проведения (например, замена титрования спектрофотометрическим анализом).
В основе методов, не предусматривающих минерализацию навески, лежат цветные реакции, которые протекают в результате взаимодействия белков с некоторыми химическими реактивами.
Определение содержания общего азота (арбитражный метод). По этому методу общий азот должен быть определен в виде аммиака (NНз) после разрушения азотсодержащего вещества (продукта) горячей концентрированной H2SO4. Образовавшийся при разложении сульфат аммония [(NH4)2SO4] следует разрушить концентрированной щелочью, и полученный NH3 отогнать с паром в титрованный 0,1 н. раствор H2SO4. Определение закончить обычным ацидометрическим титрованием.
Навеску исследуемого продукта (мука в количестве 0,2...0,5 г, фарш — 0,5...1,0 г), отвешенную с погрешностью не более 0,0001 г, следует поместить в трубочку из фильтровальной бумаги или станиоля, закрытую с одной стороны. Диаметр ее должен быть несколько меньше диаметра горла колбы, в которой будет проводиться мокрое сжигание. Около 5 г тузлука (в зависимости от содержания в нем азота) осторожно влить в колбу на 100 см3, не касаясь стенок горла последней. Затем к навеске добавить несколько мелких кристаллов медного купороса (0,2...0,3 г) и прилить 10 см3 H2SO4, плотностью 1,84 г/см3. Колбу с содержимым осторожно нагреть в вытяжном шкафу, не допуская разбрызгивания жидкости.
Когда содержимое колбы сделается однородным, нагревание прекратить, дать остыть массе, прибавить 0,5 г сернокислого калия и снова нагревать до тех пор, пока жидкость в колбе не станет прозрачной, зеленовато-голубого цвета без бурого оттенка. Внутренние стенки колбы должны быть совершенно чистыми. Это достигается осторожным взбалтыванием содержимого колбы до смывания со стенок темных обугленных частиц муки.
По окончании сжигания содержимое колбы охладить и перенести в отгонную колбу на 500...750 см3. Колбу для сжигания необходимо тщательно сполоснуть, проверяя полноту смывания путем прибавления 1...2 капель раствора метилового красного. Для перенесения сожженной навески требуется 200...250 см3 дистиллированной воды. Приемником служит коническая колба на 250...300 см3, в которую предварительно должно быть налито 25...30 см3 0,1 н. раствора H2SO4. Конец трубки холодильника должен быть погружен в раствор H2SO4.
В отгонную колбу осторожно, по стенкам, избегая смешивания жидкостей, следует прилить 50...70 см3 33%-го раствора NaOH. В колбу бросить кусочек лакмусовой бумаги и быстро закрыть пробкой, соединенной каплеуловителем с холодильником. Осторожно перемешивая содержимое колбы, сразу же начинать ее нагревание. Реакция жидкости в колбе должна быть резко щелочной. После того как жидкость в колбе бурно закипит, приемник опустить с таким расчетом, чтобы конец трубки холодильника находился на некотором расстоянии от поверхности жидкости. В таком положении продолжать отгонку до тех пор, пока из колбы отгонится не менее 2/3 содержащейся в ней жидкости. Кроме того, конец отгонки определяют проверкой реакции дистиллята по лакмусовой бумаге. Если отгонка закончена, то капля дистиллята не должна вызывать посинения лакмусовой бумаги. В конце отгонки при кипении массы появляются характерные толчки, свидетельствующие о прекращении отгонки. По окончании отгонки конец трубки холодильника смыть водой в приемную колбу и содержащийся в приемнике избыток H2SO4 оттитровать 0,1 н. раствором едкой щелочи в присутствии метилового красного или двойного индикатора метилового красного или метилового синего.
Параллельно в тех же условиях, но без навески исследуемого вещества, провести контрольный опыт.
Содержание общего азота Х (в %) вычисляется по формуле:
x = (v-v1)*k*0.0014*100 / m
где v — объем 0,1 н. раствора едкой щелочи, пошедший на титрование H2SO4 в контрольном опыте, см3; v1 — объем 0,1 н. раствора едкой щелочи, пошедший на титрование избытка H2SO4 в рабочем опыте, см3; k — коэффициент пересчета на точно 0,1 н. раствор щелочи; 0,0014 — количество азота, эквивалентное 1 см3 0,1 н. раствора едкой щелочи; т — масса навески исследуемого продукта, г.
Расхождение между параллельными определениями не должно превышать 0,3%.
Количество белковых веществ определяется путем умножения азота на коэффициент, соответствующий данному продукту (например, для сырья, содержащего белки мышечных и нервной тканей — протамины, гистоны, альбумины, глобулины — 6,25; белки опорно-трофических и эпителиальных тканей — протеиноиды, альбуминоиды, склеропротеины — 5,71).
Полумикрометод определения содержания общего азота (стандартный метод).Минерализацию навески следует проводить так же, как по арбитражному методу. Массу навески увеличивают до 0,5 г, так как в дальнейшем проводится разведение.
Колориметрический метод определения содержания общего азота (нестандартный метод). Метод основан на способности NH-, давать интенсивное ярко-желтое окрашивание с реактивом Несслера.
Определение содержания белкового и небелкового азота. Исследуемый материал должен быть смешан с водой. К смеси следует добавить реактив, осаждающий белок. Выпавший осадок белка отфильтровать и определить содержание азота в осадке и в фильтрате. Азот осадка соответствует белковому азоту, а азот фильтрата — небелковому. Если известно содержание общего азота в исследуемом материале, можно ограничиться определением азота только в осадке или в фильтрате и по разности между общим азотом в исследуемом материале и азотом в осадке или в фильтрате вычислить количество белкового азота.
Метод определения содержания белкового азота основан на способности белковых веществ образовывать с гидратом окиси меди Сu(ОН)2 соединения, не растворимые даже в горячей воде. Количество азота в полученном осадке определяется арбитражным или другим стандартным методом.
Для определения содержания азота истинных белков (белковый азот) следует отвесить 0,5...1,0 г (с погрешностью не более 0,01 г) тонко растертого в ступке исследуемого материала и поместить его в термостойкий химический стакан на 100...150 см3. Добавить 50 см3 дистиллированной воды и нагреть до кипения. К нагретой массе (смеси) прилить 25 см3 раствора медного купороса (60 г CuSO4.5H2O растворить в 1000 см3 дистиллированной воды) и при постоянном помешивании прилить 25 см3 раствора NaOH (12,5 г NaOH растворить в 1000 см3 дистиллированной воды).
После отстаивания смеси жидкость осторожно слить декантацией через бумажный фильтр, а осадок в стакане промыть несколько раз горячей дистиллированной водой, сливая промывные воды через тот же фильтр. Промывание вести до тех пор, пока фильтрат не перестанет давать реакцию на H2SO4 (проба с хлористым барием). Промытый осадок количественно перенести на фильтр, просушить и вместе с фильтром сжечь в колбе для сжигания. Все дальнейшие операции, начиная с сжигания пробы, выполнять так же, как и при определении общего азота арбитражным или другим стандартным методом с использованием в процессе минерализации катализаторов или их смеси.