Параллельно провести контрольный опыт в тех же условиях, но без навески, что позволит установить содержание азота в фильтре и в реактивах. Результаты контрольного опыта учесть при расчете содержания общего азота в исследуемом материале. Содержание истинных белков определить путем умножения полученного количества азота на коэффициент 6,25.
При определении белкового азота в мясе жирных рыб собранный на фильтре осадок после высушивания следует промыть петролейным эфиром и снова подсушить. Удаление жира облегчает последующее сжигание осадка с фильтром.
Метод достаточно хорош, но не безупречен, так как Сu(ОН)2 осаждает частично пептоны. Кроме того, целый ряд аминокислот дает труднорастворимые медные соли, которые, попадая в белковый осадок, трудно вымываются, что способствует завышению результатов определения. При наличии в исследуемом материале лецитинов, азот последних также присоединяется к белковому азоту.
Определение содержания летучих оснований азота (АЛО). К летучим основаниям относится ряд соединений, в том числе NH3 монометиламины (CH3NH2), диметиламины [(СНз)2NН] и триметиламины [(CH3)3N или ТМА]. Количественное содержание АЛО является одним из объективных показателей свежести сырья и готовой продукции. Сущность метода состоит в том, что связанные и свободные летучие основания отгоняются паром, а затем отфильтровываются.
Навеску сухого продукта (например, муки) массой около 5 г или сырого (например, фарша) массой до 10 г (отвешенную с погрешностью не более 0,01 г) следует поместить в отгонную колбу на 500 см3. В колбу добавить 250 см3 дистиллированной воды, 25 см3 5%-го магнезиального молока или 1 г окиси магния (магнезии) — MgO и, во избежание вспенивания, кусочки чистого парафина. Содержимое колбы перемешать. Реакция смеси должна быть щелочной (контролировать по внесенной в колбу красной лакмусовой бумажке). Колбу закрыть пробкой, соединяющей ее с каплеуловителем. Приемником должна служить коническая колба на 300 см3, в которую предварительно следует налить 25 см3 0,1 н. раствора НС1. Через суспензию, содержащуюся в отгонной колбе, необходимо интенсивно пропускать пар из парообразователя. При этом отгонную колбу слабо подогревать. Конец холодильника в начале отгона должен быть опущен в раствор H2SO4. Когда объем (дистиллята) в приемной колбе достигнет 200...250 см3, отгон прекратить. Окончание отгона следует контролировать с помощью лакмусовой бумажки. При нанесении на бумагу капли дистиллята, выходящего из холодильника, реакция должна быть нейтральной. После прекращения отгона содержимое приемной колбы оттитровать 0,1 н. раствором NaOH в присутствии 3...4 капель индикатора метилрота (0,2%-ный раствор метилового красного в 60%-ном этиловом спирте).
Одновременно необходимо провести контрольный опыт. Все операции проводить так же, как и в стандартном опыте, но без навески исследуемого продукта.
Содержание АЛО на 100 г исследуемого продукта (мг%) вычисляется по формуле:
x = (v-v1)*k*1.14*100 / m
где v — объем 0,1 н. раствора NaOH, пошедший на титрование контрольной пробы, см3; v1— объем 0,1 н. раствора NaOH, пошедший на титрование стандартной пробы, см3; k — коэффициент пересчета на точно 0,1 н. раствор NaOH; 1,4 — количество азота, соответствующее 1 см3 точно 0,1 н. раствора NaOH, мг; т — масса навески исследуемого вещества (продукта), г.
Расхождение между параллельными определениями не должно превышать 0,5 мг%.
Определение содержания гликогена в мясе рыбы и нерыбных объектах промысла. Гликоген — животный крахмал (С6Н10О5)N — полисахарид разветвленной структуры. Средний молекулярный вес 105...107. Состоит из остатков глюкозы в форме o-D-глюкопиранозы. Гликоген содержится в органах животных, в том числе рыб, и представляет собой резервное вещество. Легко расщепляется с образованием глюкозы, а при гидролизе с образованием молочной кислоты. Наиболее богаты гликогеном печень (до 20% на сырую массу) и мышцы (около 4% на сырую массу), очень богато им мясо беспозвоночных и моллюсков, например, в мясе мидий и устриц его содержится от 6 до 30% (на сухое вещество).
Метод определения содержания гликогена основан на его выделении из материала путем обработки последнего 30%-ным раствором щелочи с последующим гидролизом раствором НС1 для перевода в глюкозу.
Навеску исследуемою материала массой 2...4 г, взвешенную с погрешностью не более 0,0001 г, следует поместить в центрифужную пробирку, в которую предварительно налить 4...8 см3 30%-го раствора КОН. Пробирку неплотно прикрыть стеклянной пробкой и поместить (для гидролиза материала) в кипящую водяную баню на 3 ч. Через каждые 5...10 мин пробирку встряхивать. По окончании гидролиза (масса стала однородной) в пробирку добавить (при перемешивании ее содержимого стеклянной палочкой) 10 см3 90%-го спирта и снова поместить ее в водяную баню. Когда содержимое пробирки начнет кипеть, нагревание прекратить. После охлаждения уплотнить выпавший осадок гликогена центрифугированием и слить жидкость, образовавшуюся над осадком. При выпадении окрашенного осадка подвергнуть его вторичной обработке 30%-ным раствором КОН (при нагревании) и осаждению спиртом, как описано выше. Выделенный осадок гликогена промыть непосредственно в центрифужной пробирке сначала 96%-ным спиртом, а затем эфиром. После центрифугирования осторожно слить с осадка спирт и эфир и на небольшое время поместить пробирку на водяную баню для испарения остатка растворителей.
К осадку гликогена в пробирке следует добавить 6 см3 горячей дистиллированной воды, а затем нейтрализовать смесь по лакмусу, добавляя к ней сначала 2...3 капли концентрированной НС1, а затем 2,2%-ный ее раствор. После нейтрализации в пробирку внести 20 см3 2,2%-го раствора НС1, прикрыть ее стеклянной пробкой и поместить на 3 ч в кипящую водяную баню для гидролиза гликогена (превращения его в глюкозу). По окончании нагревания содержимое пробирки количественно перенести, смывая дистиллированной водой, в мерную колбу на 50 см3, нейтрализовать по лакмусу раствором КОН и довести объем содержимого, добавляя дистиллированную воду, до метки. После тщательного перемешивания содержимое колбы отфильтровать. 5 см3 фильтрата внести в обычную пробирку размером 25 х 200 мм и добавить 5 см3 окислительного реагента (см. ниже), смывая им со стенок пробирки капли исследуемого раствора. Если исследуемый раствор содержит очень большое количество гликогена, взять меньше фильтрата (2...3 см3), но обязательно прибавить к нему такое количество дистиллированной воды, чтобы объем исследуемой жидкости в пробирке составлял 5 см3. Хорошо перемешав содержимое пробирки, поместить ее на 20 мин в сильно кипящую баню, а затем быстро охладить водопроводной водой под краном. В охлажденную пробирку осторожно (без перемешивания) по стенке внести 1 см3 2,5%-го раствора KJ, а затем быстро добавить 3 см3 1 н. раствора H2SO2 при энергичном перемешивании смеси (встряхивание пробирки) и закрыть пробирку пробкой. Через 3 мин оттитровать выделившийся йод 0,01 н. раствором тиосульфата натрия (гипосульфита) в присутствии крахмала. Параллельно провести контрольный опыт. Содержание гликогена Х (в %) вычисляется по формуле:
x = (v-v1)*k*0.25*50*100 / m*v2*1000
где v — объем 0,01 н. раствора тиосульфата натрия, пошедший на титрование в контрольном опыте, см3; v, — объем 0,01 н. раствора тиосульфата натрия, пошедший на титрование в рабочем опыте, см3; v2 — объем фильтрата, взятый для обработки окислительным реагентом, см3; k — коэффициент пересчета на точнo0,01 н. раствор тиосульфата натрия; 0,25 — количество (С6Н10О5)N, эквивалентное1 см3 0,01 н. раствора тиосульфата натрия, мг; 50 — объем всей жидкости в мерной колбе, полученный после гидролиза осадка (С6Н10O5), см3; т — масса навески исследуемого материала, г; 1000 — пересчет миллиграммов в граммы.
Расхождение между параллельными определениями не должно превышать 0,5%.
Примечание. Для проведения опыта должен быть приготовлен окислительный реагент — 28 г двузамещенного фосфата натрия (Na2HP04) и 40 г сегнетовой соли (калиево-натриевая соль винной кислоты — KNaC4H406 • 4Н20); их следует растворить в 500 см3 дистиллированной воды. К полученному раствору добавить 100 см3 1 н. раствора NaOH, прилить при помешивании 80 см3 10%-го раствора сернокислой меди (CuSO4 • 5Н20) и добавить 180 г сульфата натрия (Na2SO4). После растворения Na2SO4 жидкость перенести в мерную колбу на 1000 см3, добавить 50 см3 0,1 н. раствора KI и довести объем жидкости до метки, добавляя дистиллированную воду. Полученный раствор отстаивать в течение одного-двух дней, отфильтровать и хранить в плотно закрытой склянке из темного стекла. Реактив пригоден к употреблению при работе с растворами глюкозы концентрации не более 0,5 мг в 5 см3.
2.4 Определение содержания золы
Метод основан на полном сжигании органических веществ, удалении продуктов их сгорания и определении оставшейся минеральной составной части (золы) исследуемого материала.
Навеску массой 3...5 г, взвешенную с погрешностью не более 0,0001 г, следует поместить в предварительно прокаленный до постоянной массы платиновый или фарфоровый тигель и озолить, предварительно обуглив. Если исследуемое вещество влажное, тигель с навеской поместить в сушильный шкаф для подсушивания навески. При анализе сухого рыбного белка брать навеску массой 1...1,5 г.
Для обугливания тигель с исследуемой навеской необходимо нагреть на слабом огне (на песочной бане или асбестовой сетке нагревательного прибора), избегая вспучивания и разбрызгивания содержимого тигля, а затем на более сильном огне до прекращения выделения газов, не давая веществу воспламеняться. Окончательное озоление навески проводить в муфельной печи при температуре 300...400°С, повышая ее к концу процесса озоления до 500°С (начало темно-бурого каления). Если при озолении частицы угля исчезают очень медленно, тигель охладить, содержимое смочить горячей дистиллированной водой или 3%-ным раствором перекиси водорода. Затем осторожно выпарить воду, не доводя ее до кипения во избежание потерь золы при разбрызгивании. После выпаривания золу подсушить и прокалить до исчезновения частиц угля. Смачивание и прокаливание продолжать до тех пор, пока частицы угля не исчезнут.