Подготовка препаратов. Из полученных срезов готовят временные или постоянные препараты. Изучать древесину и целлюлозные материалы с помощью микроскопа через воздушную прослойку нецелесообразно, так как вследствие отражения лучей света от боковых частей материала его контуры будут видны очерченными слишком темными линиями. Поэтому исследуемый материал заключают в какую-либо жидкость, которая уменьшает отражение лучей и увеличивает прозрачность.
Для более контрастного выявления особенностей строения анатомических элементов на срезах древесины до заключения их в ту или иную среду проводят окрашивание. Наиболее часто для окраски применяют 1%-ный водный раствор сафранина или комбинацию красителей: сафранин и водный синий; хризоидин и водный синий либо светлый зеленый. Срезы помещают в ванночку с красителем и выдерживают в нем в течение 5 мин, затем избыток красителя отмывают водой, глицерином или спиртом.
Приготовление временных препаратов. Каплю воды наносят пипеткой или стеклянной палочкой на середину чистого сухого предметного стекла, препаровальными иглами переносят в нее срез и накрывают покровным стеклом. Покровное стекло прикладывают к предметному под острым углом так, чтобы оно касалось края капли; после этого его осторожно опускают. Капли жидкости, выступающие по краям покровного стекла, удаляют слегка смоченной фильтровальной бумагой, подводя ее к одному краю покровного стекла. Если жидкости под стеклом мало, ее добавляют, приподняв покровное стекло, или наносят каплю воды вплотную к краю покровного стекла. При резком опускании покровного стекла в жидкости остаются пузырьки воздуха, заметные под микроскопом, в виде черных резко очерченных кружков, которые мешают изучению объекта в микроскопе.
Временные препараты могут быть использованы для исследований только на одном занятии. Долго сохранять их невозможно, так как вода быстро испаряется.
Приготовление постоянных препаратов. Для сохранения препарата в течение длительного времени окрашенные срезы древесины заключают не в воду, а в глицерин-желатиновую смесь или в пихтовый бальзам. Перед заделкой срезы обезвоживают.
В случае приготовления глицерин-желатиновых препаратов воду и избыток красителя из срезов удаляют тщательной промывкой глицерином с его отсасыванием. Эту операцию можно проводить на воронке фильтрующей обратной типа ВФОТ диаметром 10...20 мм. После этого срезы заключают в глицерин-желатину.
Глицерин-желатину стеклянной палочкой наносят на срез, предварительно помещенный на предметное стекло. Чтобы глицерин-желатина сразу не застыла на холодном предметном стекле, его слегка подогревают на спиртовке. На теплую каплю накладывают покровное стекло, также прогретое на пламени спиртовки, и кончиком иглы осторожно придавливают стекло, равномерно распределяя глицерин-желатину. Когда среда остынет, края покровного стекла можно обвести лаком, чтобы предотвратить высыхание желатины. Этот способ приготовления препаратов достаточно простой, но срезы со временем обесцвечиваются.
Для заключения среза в бальзам процесс обезвоживания осуществляется значительно сложнее, так как ксилол, в котором растворен бальзам, совершенно не смешивается с водой. Вода, оставшаяся в срезе, образует муть. Обезвоживание проводят водным этанолом восходящей концентрации: 40%-ным в течение I мин; 70 и 96%-ми — по 2 мин. Для удаления последних следов воды срез обрабатывают двумя каплями фенол-ксилола в течение 2...3 мин и после просветления для удаления фенола срез промывают в чистом ксилоле.
Для заключения препарата в бальзам одну-две капли его раствора в ксилоле наносят стеклянной палочкой на срез и накладывают покровное стекло. Слегка надавливая на покровное стекло препаровальной иглой, удаляют из под него избыток бальзама и пузырьки воздуха. Выступивший вокруг покровного стекла бальзам удаляют нагретым копьецом или перочинным ножом. Через несколько дней бальзам у краев стекла подсохнет и препарат может быть окончательно вычищен бензином.
Все операции по заключению в бальзам и глицерин-желатину могут быть проведены непосредственно на предметном стекле. Обычно на одно предметное стекло помещают рядом три среза: поперечный срез располагают слева, а продольные — справа один под другим. За ходом обработки следят при малом увеличении микроскопа или в штативной лупе, не покрывая срезы покровным стеклом. Готовые постоянные препараты хранят в коробочках в вертикальном положении.
Методика мацерации древесной ткани. Мацерацию древесной ткани осуществляют разрушением межклеточного вещества в результате делигнификации сильными окислителями. Наиболее часто в качестве окислителей используют 10 или 20%-ные растворы хромовой кислоты или концентрированную азотную кислоту с добавлением небольшого количества хлората калия.
Мацерацию древесины азотной кислотой осуществляют следующим образом: кусочек древесины толщиной в спичку и длиной 10...20 мм вырезают из той или иной части ствола дерева, помещают в пробирку, заливают 3...4 см-1 концентрированной азотной кислоты и вносят кристаллик бертолетовой соли. Пробирку нагревают на небольшом пламени спиртовки при слабом кипении в течение 3...4 мин. Чтобы не произошло выброса смеси, необходимо нагревание проводить осторожно по всей поверхности пробирки. Нагревание прекращают при первых признаках мацерации, т.е. при появлении в жидкости отдельных волокон и их пучков. После охлаждения мацерированную древесину промывают дистиллированной водой путем многократного декантирования. Из полученных мацерированных волокон готовят препараты по указанной выше методике и исследуют с помощью оптического микроскопа.
Работа с микроскопом. Перед работой с микроскопом необходимо ознакомиться с инструкцией по его эксплуатации. Приступая к работе с микроскопом, необходимо снять с него чехол, аккуратно протереть от пыли мягкой тканью, затем с помощью зеркала и источника света, глядя в окуляр, добиться яркого, равноосвещенного поля зрения.
Для получения отчетливого изображения предметное стекло с изучаемым объектом помещают на предметный столик и с помощью макрометрического винта перемещают зрительную трубу по высоте, пока объект не будет ясно виден. Далее посредством микрометрического винта микроскоп устанавливают таким образом, чтобы можно было рассмотреть препарат по всей его толщине.
При исследовании препаратов древесины необходимо рассмотреть под микроскопом и зарисовать изображение всех трех срезов, отмечая при этом основные анатомические элементы. Наблюдаемые срезы необходимо сравнить с микрофотографиями аналогичных образцов древесины в литературе; и др. В лаборатории по анатомии древесины должны также иметься соответствующие атласы и плакаты. По окончании работы следует убрать препарат, удалить пыль и следы жидкости с предметного столика и покрыть микроскоп чехлом.
4. Исследование срезов древесины хвойных пород
Древесина хвойных пород имеет сравнительно простое строение и состоит главным образом из ранних и поздних трахеид, которые занимают свыше 90% ее объема. Ранние трахеиды, образующиеся весной и летом, имеют тонкие стенки и широкие полости и являются водоироводящими элементами. На радиальных стенках трахеид находятся многочисленные окаймленные поры, обеспечивающие движение восходящего тока из клетки в клетку. Поздние трахеиды — толстостенные с узкими полостями. Они длиннее ранних, имеют меньшее число пор и выполняют механическую и частично запасающую функции. Длина трахеид от 2,6 до 5,0 мм. Радиальный размер ранних трахеид составляет в среднем 40 мкм, поздних — 20 мкм. Живая паренхимная ткань представлена паренхимой сердцевинных лучей, В древесине некоторых хвойных имеются смоляные ходы. Они представляют собой межклеточные каналы, выстланные по периферии паренхимными клетками.
Анатомическое строение древесины хвойных пород рассмотрим на примере древесины сосны обыкновенной. Схема строения древесины сосны представлена на рис. 3.
Поперечный срез древесины. Рассматривая поперечный срез, следует найти все слагающие древесину клетки — тонкостенные ранние и толстостенные поздние трахеиды. Tpaхеиды должны быть расположены правильными рядами и иметь форму, близкую к прямоугольнику. Срединные пластинки будут отчетливо видны как тонкие линии, расширяющиеся в местах сближения трех-четырех клеток. Не составляет труда обнаружить границу годичного слоя — границу между поздними трахеидами предыдущего года и ранними трахеидами следующего. Необходимо рассмотреть сердцевинные лучи. Они узкие, большей частью однорядные, пересекают годичные слои по радиусу. Следует разыскать среди трахеид вертикальные смоляные ходы, которые, как правило, находятся в поздней части годичного слоя. На поперечном срезе хорошо видны их округлые каналы, окруженные живыми клетками эпителия. Диаметр смоляного хода примерно равен поперечнику четырех трахеид. Эпителий смоляных ходов сосны состоит из тонкостенных клеток. При изготовлении препаратов эти клетки сминаются или рвутся, на срезах они часто видны в виде отверстия с неровными краями. Однако в препарате всегда можно найти смоляные ходы и в хорошем состоянии.
Радиальный срез. На радиальном срезе нужно найти хорошо заметные годичные слои, включающие ранние трахеиды с широкими полостями и поздние толстостенные трахеиды с узкими полостями. При рассмотрении среза можно заметить, что весенние трахеиды в радиальном направлении по размеру больше, чем в тангенциальном, концы трахеид слегка закруглены. На стенках трахеид видны многочисленные окаймленные поры. Осенние трахеиды на радиальном разрезе меньше, чем на тангенциальном; концы их заострены. Обратить внимание на немногочисленность пор. Они малозаметны и у некоторых трахеид вообще отсутствуют. Поэтому окаймленные поры в поздних трахеидах лучше рассматривать на тангенциальном срезе. Окаймленные поры на препарате найти очень легко, так как такая пора на радиальной стенке ранней трахеиды представлена в виде двух хорошо заметных окружностей, вписанных одна в другую. Большая окружность — это дно камеры поры, меньшая — отверстие. Между большой и малой окружностями при большом увеличении можно видеть ясно выраженный торус, в виде несколько размытого с неровными краями кружка.