Биосинтез аминокислот (стр. 2 из 3)

3.3 Получение лизина

Если аминокислота предусмотрена в качестве добавки к кормам, то биотехнологический процесс кормового продукта включает следующие стадии: ферментацию, стабилизацию аминокислоты в культуральной жидкости перед упариванием, вакуум - упаривание, стандартизацию упаренного раствора при добавлении наполнителя, высушивание и упаковку готового продукта, в котором должно содержатся не более 10 % основного вещества. Например, в промышленности изготавливают сухой кормовой и жидкий кормовой концентраты лизина наряду с кристаллическим лизином.(рис. 2)

Рисунок №2

1 - емкость для культуральной жидкости (КЖ),

2 - ионообменные колонны,

3 - сборник злюата,

4 - сборник фильтрата,

5 - емкость для элюата,

6 - насос,

7 - вакуум - выпарной аппарат,

8 - циклон,

9 - сушилка кормового концентрата,

10 - сборник,

11 - реактор - кристаллизатор,

12 - центрифуга,

13 - сушилка.

Если концентрат содержит 70 - 80 % сухих веществ, то достаточно устойчив против микробной порчи за счет повышенной осмотической концентрации ингредиентов.[5]

3.4 Получение аминокислот с помощью иммобилизованных ферментов и клеток

Экономически целесообразным являются способы получения аминокислот с помощью иммобилизованных ферментов и клеток. Сравнительно давно реализован процесс получения L - аспаргиновой кислоты из фумаровой и аммиака в одну стадию с помощью иммобилизованных клеток Е. coli или Pseudomonasaeruginosa, обладающая аспартазной активностью (см схему)

Аспартаза катализирует реакцию присоединения аммиака к фумаровой кислоте. Фермент в иммобилизованном состоянии сохраняет активность на исходном уровне 2 -2,5 недель и более.

L - Аспаргиновую кислоту можно получить и с помощью иммобилизованных клеток, что существенно повышает длительность функционирования системы, производительность которой по целевому продукту составляет около 2000 кг с 1м реактора. Периодические ферментации используют при получений других L - аминокислот (глутаминовой, фенилаланина, лизина, триптофана и др. ). При этом культивируют обычно специальные мутантные штаммы, метаболизм которых по целевому продукту изучен достаточно полно. Так, например, установлено, что лимитирующем агентом коринебак герий, образующих глутаминовую кислоту, является биотип в дозе 1 - 5 мкг/ л. Биотин индуцирует структурно - функциональные изменения в клеточной мембране, благодаря чему увеличивается ее проницаемость для глутаминовой кислоты, выходящей из клетки в культуральную жидкость. Отдельные штаммы продуцентов способны накапливать ее более 50 г/л на мелассных средах.

Роль биотина аналогична в случае получения пролина, являющимся производным глутаминовой кислоты.

Несложность этой технологии и ее преимущества по сравнению с глубинной ферментацией наглядно иллюстрируют опыт японской фирмы «Танабе Сейяку ». В 1973 году эта фирма разработала способ получения аспарагиновой кислоты при помощи иммобилизованных бактериальных клеток, обладающих аспартазной активностью. Аспартаза катализирует присоединение аммиака по двойной связи фумаровой кислоты, т.е. аспарагиновая кислота образуется в одной стадии и данный биотехнологический процесс можно отнести к категории биотрансформации органических соединений. Иммобилизованный в геле фермент функционировал хорошо, длительность его полуинактивации составила 1 месяц. Затем в геле иммобилизовали клетки продуцента, дополнительно стабилизируя их путем химического связывания между собой и с гелем. Длительность полуинактивации клеток в этом случае увеличивалась до 4 месяцев. Технологию биотрансформации фумаровой кислоты, таким образом, можно представить в такой последовательности:

выращивание клеток методом глубинной ферментации и их выделение центрифугированием;

иммобилизация клеток биокатализатора в геле в виде гранул размером 2 -3 мм;

биотрансформация фумарата аммония в колонке с катализатором в проточном режиме и получение раствора аспарагиновой кислоты;

кристаллизация, центрифугирование и промывка кристаллов.

Производительность системы биотранеформации аспарагиновой кислоты 1 м биореактора 1700 кг.

3.5. Технология получения глутамата.

В основе сверхсинтеза глутаминовой кислоты из глюкозы у этих бактерий лежат два биохимических принципа: недостаток фермента а - кетоглутаратдегидрогеназы и блокировка биосинтеза биотина. Неспособность клеток синтезировать биотин приводит к увеличению проницаемости цитоплазмотической мембраны, что повышает экскрецию глутамата. Он образуется в результате аминирования а - кетоглутарата, неспособного к дальнейшим превращениям в цикле трикарбоновых кислот. Схема биосинтеза глутамата из глюкозы у данного типа мутантов показана на рис. 3

При биосинтезе глутаминовой кислоты очень большое значение имеет концентрация биотина в среде. Необходимо обеспечить его концентрацию 1 - 5 мкг /л. В этом случае нарушается нормальный синтез фосфолипидов мембраны и последняя становится проницаемой для глутамата. При концентрации биотина 15 мкг/л наблюдается интенсивный рост биомассы. Проницаемость цитоплазмотической мембраны для глутамата можно снизить также при помощи пенициллина, добавляя его к среде во время логарифмической фазы роста. В этом случае фосфолипиды экстрагируются из мембраны и транспорт глутамата может осуществляться в течение 40 - 50 часов. Бактериальный синтез глутамата позволяет получать примерно 50 % - ный выход продукта из сахара и накапливать в среде ферментации до 200 г/л глутамата. Известны методы получения глутамата на этанольных средах ( до 60 г/л ) или на ацетате (до 98 г/ л ).[6]

4. ПРОМЫШЛЕННЫЙ СИНТЕЗ АМИНОКИСЛОТ

Промышленное производство аминокислот осуществляется двумя способами: микробиологическим и химическим.

4.1 Микробиологический синтез

Микробиологический синтез основан на выращивании определенных видов микроорганизмов на питательных средах, имеющих подходящий источник углерода. Чаще всего это сахара, содержащиеся, например, в патоке. Мутированные микроорганизмы с нарушенным азотным обменом выделяют в раствор большое количество какой-либо одной аминокислоты. После окончания процесса ферментации аминокислоту выделяют из раствора химическими методами

Путем микробиологической ферментации получают основное количество глутаминовой кислоты и весь лизин. У этого процесса свои преимущества и свои недостатки. С одной стороны, в нем мало стадий и требуется относительно простая и универсальная аппаратура. С другой стороны, живые микроорганизмы, с которыми приходится работать, очень чувствительны к малейшему изменению условий, а концентрация целевого продукта получается низкой, что ведет к увеличению размеров аппаратуры.

Существует способ микробиологического получения фенилаланина при помощи тирозин - и метиониндефицитного мутанта Brevibacteriumlactofermentum. В периодическом процессе ферментации достигнута концентрация продукта 24,8 г/л. Однако для данного процесса требуются сложные и дорогие среды. Определенный интерес представляют биосинтез фенилаланина ауксотрофным мутантом Е. coli, который можно культивировать в глюкозной среде с фосфатами. Процесс ферментации осуществляют доливным методом с рециркуляцией биомассы. Биомасса в реакторе 60 - му часу достигает 45 - 50 г/л, а концентрация фенилаланина - 22,4 - 22,8 г/л. Продуктивность системы 0,72-0,86 г/( лч ); выход продукта 0,11г.

4.2 Химический синтез

Химический синтез более универсален, чем микробиологический, и позволяет получать соединения любой возможной структуры. Здесь используется непищевое минеральное сырье, достигается любая концентрация продукта, однако, как правило, процесс многостадиен и требует более сложной аппаратуры.

Оба способа обеспечивают получение природных аминокислот необходимой степени химической и оптической чистоты. Так что в конечном счете, когда речь идет о промышленном производстве, последнее слово остается за экономикой: по данным зарубежных специалистов, при больших масштабах химические методы становятся более рентабельными.

Наиболее широко разработан промышленный синтез метионина- аминокислоты, главным потребителем которой является птицеводство. Исходным веществом служит пропилен - продукт крекинга нефти. Пропилен окисляется до акролеина, который в результате серии реакций, превращается в рацемический метионин.

В результате химического синтеза обычно получается смесь равных количеств L и D - изомеров аминокислот, в то время как в состав белков входят исключительно L-изомеры. Эти же изомеры питательны. D-изомеры организмом, как правило, не усваиваются и являются балластом. Следовательно, необходимо разделение, что неминуемо отрицательно сказывается на экономике. В последнее время в области расщепления рацемических смесей аминокислот достигнуты серьезные успехи. В работах СВ. Рогожина и В.А. Даванкова показано, что оптически неактивные аминокислоты, будучи ковалентно присоединены к нерастворимому полимерному носителю, легко образуют комплексы с медью, никелем и т.п. другая рацемическая аминокислота, находящаяся в растворе, занимает два вакантных координационных места у атома металла, причем прочность комплексов L - и D - изомеров различна. Сколь ни мало это различие, будучи повторенным многократно в процессе хромотографии, оно обеспечивает полное или частичное разделение оптических антиподов. Наилучшие результаты получены с DL - пролином, который может быть препаративно разделен на оптические изомеры.