4.2 Приготовление посевного материала
Посевной материал готовится в две стадии: сначала в колбах, а затем в посевных аппаратах при аэрации (11/мин) и интенсивном перемешивании и автоматическом регулировании температуры (300С) и рН=7 в соответствии с регламентом.
Если в качестве источника углерода используют уксусную кислоту (ацетат аммония), то, вследствие угнетающего действия ацетат-ионов на рост клеток при концентрации выше 2 %, осуществляют дробную подачу субстрата по мере его потребления.
Промышленными продуцентами лизина являются гомосериндефицитные мутанты ауксотрофных бактерий родов Brevibacterium, Micrococcus, Corynebacterium.
Клетки Brevibacteriumsp. 22 культуры представляют собой неподвижные грамположительные палочки длиной 1,2—2,5 мкм, но иногда могут иметь овальную или круглую форму.
Клетки имеют максимальную длину в логарифмической фазе роста. У быстрорастущих клеток хорошо выражен рибосомальный белоксинтезирующий аппарат, а у медленно растущих, но интенсивно синтезирующих лизин — мембранная система. У клеток, интенсивно синтезирующих лизин, большую активность проявляют и ферменты цикла Кребса, многие из которых связаны с мембранами.
Среди источников азота наиболее часто используют соли аммония и кукурузный экстракт (получают обработкой кукурузных жмыхов серной кислотой при 90–100 °С), кислотные гидролизаты дрожжей или казеина. Последние содержат необходимые ауксотрофному штамму аминокислоты и витамины. Оптимальное соотношение углерода и азота в среде составляет 11 : 1 (при его увеличении выход лизина падает, при уменьшении накапливается аланин). В питательной среде также должны содержаться соли калия, магния и фосфора (табл. 2).
Таблица 2.
Состав питательных сред при выращивании продуцента лизина (%)
| Компоненты | Посевной аппарат | Промышленный ферментер |
| Мелассная среда | ||
| Меласса (по содержанию сахара) | 7,5 | 7–12 |
| Кукурузный экстракт (содержание СВ 50 %) | 2 | 1,2–1,5 |
| Сульфат аммония | 2 | 2 |
| Однозамещенный фосфат калия | 0,05 | 0,05 |
| Двухзамещенный фосфат калия | 0,05 | 0,05 |
| Мел | 1 | 1 |
| Пеногаситель синтетический | 0,1 | 0,1 |
| Вода | Остальное | Остальное |
| рН среды | 6,9–7,0 | 7,0–7,2 |
| Ацетатная среда | ||
| Ацетат аммония | 1,5 | 1,5 |
| Глюкоза | 1,0 | 1,0 |
| Однозамещенный фосфат калия | 0,02 | 0,02 |
| Сульфат магния | 0,04 | 0,04 |
| Сульфат аммония | 3,0 | 3,0 |
| Гидролизат соевой муки | 1,5 | 1,5 |
4.3 Условия культивирования
Общая схема производства препаратов лизина представлена на рис. 2
Процесс получения лизина требует строгих асептических условий.
Выращивание производственной культуры продуцента лизина обычно осуществляется периодическим способом в ферментаторах, объем которых составляет 50, 63 или 100 м3. Посевной материал в количестве 5–10 об. % от объема питательной среды поступает в ферментатор. Сразу после засева в него подается воздух, нагретый до 50 °С, из расчета 1 объем воздуха на 1 объем питательной среды в минуту при давлении 0,12–0,13 МПа.
Продолжительность ферментации составляет 55–72 ч, процесс проводят при интенсивном перемешивании среды, температуре 28–32 °С, рН = 7,0÷7,5 (поддерживается добавлением в среду аммиачной воды) и периодической подачей стерильного пеногасителя.
Процесс культивирования состоит из двух стадий. В первые сутки клетки потребляют около 25 % углеводов и азотистых веществ; в это время накапливается почти вся биомасса. На второй стадии скорость накопления биомассы резко снижается, но в КЖ происходит накопление лизина. По окончании процесса перестает потребляться титрующий агент (аммиачная вода) и концентрация лизина составляет 60–100 г/л, биомассы накапливается 10–15 г/л (СВ), коэффициент потребления сахара в расчете на лизин составляет 25–35 %.
5. Получение препаратов лизина
В зависимости от назначения из КЖ можно получить различные микробиологические препараты (рис. 2): жидкий концентрат лизина (ЖКЛ), сухой кормовой концентрат лизина (ККЛ), кристаллический лизин.
5.1 Жидкий концентрат лизина
Для получения ЖКЛ и ККЛ культуральную жидкость, содержащую 10–13 % СВ, подкисляют HCl до рН = 5,0 и добавляют 0,15% раствор гидросульфита натрия для стабилизации лизина. Стабилизированную культуральную жидкость упаривают под вакуумом до 35–40 % СВ.
5.2 Сухой концентрат лизина (ККЛ) получают, высушивая ЖКЛ в распылительных сушилках до влажности 5–6 %. Сухой ККЛ очень гигроскопичен, поэтому сразу после сушки его упаковывают в полиэтиленовые мешки.
Менее гигроскопичный ККЛ получают, высушивая ЖКЛ вместе с наполнителями (костной мукой, кормовыми дрожжами, пшеничными отрубями и др.).
В состав кормовых препаратов входят помимо лизина и другие аминокислоты, а также витамины, макро- и микроэлементы (табл. 3).
Таблица 3.
Химический состав кормовых препаратов лизина
| Компонент | Содержание |
| Аминокислоты, масс. % от массы СВ | |
| Лизин | 15–20 |
| Глутаминовая кислота | 2,5–3,7 |
| Валин | 1,2–4,8 |
| Аланин | 1,3–3,1 |
| Аспарагиновая кислота | 0,8–1,4 |
| Лейцин | 0,6–1,1 |
| Пролин | 0,3–2,8 |
| Глицин | 0,6–0,9 |
| Аргинин | 0,3–0,8 |
| Тирозин | 0,4–0,7 |
| Метионин | 0,4–0,6 |
| Изолейцин | 0,4–0,6 |
| Фенилаланин | 0,2–0,6 |
| Триптофан | 0,5–0,6 |
| Серин | 0,4–0,6 |
| Треонин | 0,3–0,6 |
| Гистидин | 0,2–0,3 |
| Цистеин | 0,2–0,3 |
| Азотистые вещества, масс. % от массы СВ | |
| Общий азот | 5,2–7,9 |
| Протеин (N6,25) | 37,5–49,4 |
| Азот: | |
| белковый | 1,9–3,6 |
| α-аминный | 0,9–2,0 |
| аммиачный | 0,3–1,4 |
| Бетаина | 0,82–1,66 |
| Бетаин | 6,0–13 |
| Витамины, мкг/г | |
| Тиамин (витамин В1) | 1,7–9,7 |
| Рибофлавин (витамин В2) | 84,2–160 |
| Пантотеновая кислота (витамин В3) | 30–60 |
| Фолиевая кислота (витамин В4) | 10–20 |
| Пиридоксин (витамин В6) | 100–340 |
| Никотиновая кислота (витамин РР) | 8–10 |
| Другие органические вещества, масс. % от массы СВ: | |
| редуцирующие вещества | 4,6–12,7 |
| Жиры | 1,3 |
| клетчатка | 0,3 |
| Минеральные вещества, масс. % от массы золы | |
| Зола, масс. % от массы СВ | 19,0–28 |
| Кальций | 5,2–12,5 |
| Калий | 28,6–33,6 |
| Натрий | 0,8 |
| Магний | 1,1–1,5 |
| Железо | 0,1–0,25 |
| Фосфор | 2,2–4,4 |
| Кремний | 10,9–11,5 |
| Микроэлементы, мг/100 г | |
| Цинк | 1821 |
| Кобальт | 67,8 |
| Кадмий | 476,7 |
| Молибден | 545,9 |
| Марганец | 3071 |
| Медь | 280 |
5.3 Кристаллический лизин выделяют из КЖ после отделения биомассы.
Для получения кормовых продуктов пригодны препараты лизина с содержанием основного вещества (лизинмонохлоргидрата) от 70 % и выше. При этом допускается окраска кристаллов в желтый и светло-коричневый цвета. К препаратам медицинского назначения предъявляются более жесткие требования; для парентерального питания содержание основного вещества должно быть не ниже 99 %.
При нормальном течении процесса доля побочных аминокислот не превышает 3 % от содержания лизина, доля микробных клеток — 1,5 %. Для отделения биомассы от КЖ используют саморазгружающиеся сепараторы, а также фильтрование с намывным слоем либо на барабанном вакуум-фильтре, либо на рамных фильтр-прессах с последующей промывкой осадка водой.
Растворы, содержащие лизин, после подкисления соляной кислотой (рН = 5,0÷5,2) и введения стабилизатора (NaHSO3) концентрируют выпариванием в вакууме до 45–50 % СВ. Полученный концентрат подвергают кристаллизации, которую проводят при 5–12 °С в течение 1–2 сут. Осадок отделяют от маточника в проточных промышленных центрифугах и далее высушивают в распылительной сушилке или в кипящем слое. Готовый продукт, как правило, окрашен в коричневый цвет и содержит не менее 70 % основного вещества.
Другим способом выделения лизина является ионообменный процесс. Для этого раствор продукта подкисляют H2SO4 до рН = 1,6÷2,0, в результате чего образуется дикатион аминокислоты. После хемосорбции на катионите (КУ-2х8), используемом в Н+ илиNH4+ форме, отделяются примеси нейтральной и кислотной природы. Аминокислоты элюируют из катионита 0,5–5 % гидроксида аммония, раствор упаривают, подкисляют HCl до рН = 4,9÷5,0, а концентрат кристаллизуют при 5–12 °С, получая кристаллы монохлоргидрата лизина светло-желтого или светло-коричневого цвета, которые после высушивания содержат 90–95 % основного вещества и 1,0–12,5 % золы. Для получения препарата более высокой степени чистоты в схему очистки включают стадию обработки раствора активным углем, перекристаллизацию из 50% этанола и др.