6 Бактериальные эндотоксины.
Испытание на бактериальные эндотоксины проводят для определения наличия эндотоксинов, источником которых являются грамотрицательные бактерии, с использованием лизата амебоцитов мечехвоста Limulus polyphemus.
Существует три принципа проведения данного испытания: принцип гель-тромба, основанный на образовании геля; турбидиметрический принцип, основанный на помутнении в результате расщепления эндогенного субстрата; хромогенный принцип, основанный на появлении окраски после расщепления синтетического пептидно-хромогенного комплекса.
Испытание выполняют в условиях, не допускающих загрязнения посторонними эндотоксинами. Всю стеклянную посуду и другую термоустойчивую аппаратуру депирогенизируют в сухожаровом шкафу с использованием процесса с подтвержденной эффективностью. Общеприняты минимальные значения времени и температуры обработки, составляющие 30 минут и 250°С, соответственно. При использовании пластиковой аппаратуры, например, микротитрационных планшетов и наконечников для автоматических пипеток, следует продемонстрировать отсутствие на ней поддающихся определению эндотоксинов и мешающих факторов.
Исходный стандартный раствор эндотоксина готовят и хранят, следуя спецификациям, приведенным на листке-вкладыше и этикетке.
Приготовление испытуемых растворов. Испытуемые растворы готовят путем растворения или разбавления активных субстанций или медицинской продукции с использованием воды для испытания на бактериальные эндотоксины ИБЭ.
При необходимости, доводят значение рН испытуемого раствора (или его разведения) так, чтобы рН его смеси с лизатом находилось в интервале, предписанном производителем лизата.
Определяют максимально допустимое разведение (МДР) - максимальное разведение образца, при котором может быть определено предельное содержание эндотоксина.
Предел эндотоксина для активных субстанций, предназначенных для парентерального введения, указывается в частных статьях и выражается в таких единицах, как МЕ/мл, МЕ/мг, МЕ/(единица биологической активности) и т.д.
Принцип гель-тромба.
Гель-тромб-методы позволяют определять наличие и количество эндотоксинов и основываются на эффекте свертывания лизата в присутствии эндотоксинов. Концентрация эндотоксинов, требующаяся для свертывания лизата в стандартных условиях, представляет собой указанную на этикетке чувствительность лизата. Для обеспечения точности и достоверности испытания указанную чувствительность лизата следует подтвердить, а также провести испытание на мешающие факторы.
Предварительные испытания: подтверждение заявленной чувствительности лизата. Перед использованием лизата в испытаниях указанную на этикетке чувствительность, выраженную в МЕ/мл, следует подтвердить в четырех повторностях.
Готовят стандартные растворы не менее, чем четырех концентраций. В каждой из пробирок смешивают раствор лизата с равным объемом одного из стандартных растворов (например, по 0,1 мл каждого). Если используются одноразовые флаконы или ампулы с лиофилизированным лизатом, растворы добавляют непосредственно в ампулу или флакон. Реакционную смесь инкубируют в течение определенного периода, в соответствии с рекомендациями производителя лизата (обычно 37±1° С в течение 60±2 минут), избегая вибрации. Исследуют целостность геля: при использовании пробирок каждую из них по очереди извлекают из инкубатора и переворачивают одним плавным движением приблизительно на 180° . Если образуется твердый гель, остающийся на своем месте после переворачивании, результат записывают как положительный. Результат отрицательный, если неповрежденного геля не образуется.
Результаты испытания считают достоверными, если низшая концентрация стандартных растворов во всех повторностях дает отрицательный результат.
За конечную точку принимают последний положительный результат в нисходящем ряду концентраций эндотоксина. Вычисляют среднее значение логарифмов концентраций в конечных точках и, затем, антилогарифм этого среднего значения. Среднее геометрическое концентраций в конечных точках представляет собой измеренную чувствительность раствора лизата (МЕ/мл). Если это значение составляет не менее 0,5λ и не более 2λ, чувствительность, указанную на этикетке, считают подтвержденной и используют в испытаниях, выполняемых с этим лизатом.
Предельное испытание. Методика. Готовят растворы A, B, C и D в соответствии с Таблицей в ГФРБ и выполняют испытание для этих растворов в соответствии с указаниями подраздела “Предварительные испытания”, “Подтверждение чувствительности лизата, указанной на этикетке”.
Растворы А и В (положительный контроль с препаратом) готовят в разведениях не выше МДР и обрабатывают в соответствии с указаниями подразделов“Предварительные испытания”, “ Определение мешающих факторов”. Растворы В и С (положительные контроли) содержат стандарт эндотоксина в концентрации, соответствующей двукратной заявленной чувствительности. Раствор D (отрицательный контроль) представляет собой воду для ИБЭ.
Интерпретация. Результаты испытания считают достоверными, если положительные контрольные растворы В и С в обеих повторностях дают положительный результат, араствор D – отрицательный результат.
Испытуемый препарат выдерживает испытание, если для раствора А в обеих повторностях получен отрицательный результат. Если для раствора А в обеих повторностях получен положительный результат:
- если при этом испытуемый раствор разбавлен до МДР, он не выдерживает испытание,
- если степень разведения препарата менее МДР, испытание повторяют с использованием разведения, не превышающего МДР.
В случае, если для одной из повторностей раствора А получен положительный результат, а для другой – отрицательный, испытание повторяют.
Нанесение надписи на ампулы производится на полуавтомате, устройство которого изображено на рисунке 8.
В бункер (7) загружают ампулы и барабаном подачи (8) направляют к офсетному цилиндру, на котором нанесены буквы и цифры надписи, вдавленные виде углубления в 40-50 мкм. Формный цилиндр (5) , вращаясь в ванне с быстровысыхающей краской для глубокой печати, подает ее на офсетный цилиндр. Избыток краски с помощью ракеля (4) и регулирующего устройства снимается с поверхности офсетного цилиндра и остается в глубине надписи. При контакте надпись наноситься на ампулу и быстро высыхает.
Ампулы нейтрального стекла АС-3 с раствором упаковывают в коробки из картона по 10 штук. В каждую коробку вкладывают нож для вскрытия ампул. На коробку наклеивают этикетку из бумаги этикетной или писчей. Далее упаковывают в транспортную тару.
Таблица 4. Состав
| Наименование | Состав на 1 л: | Состав на 1 000 л: |
| Натрия хлорида | 9 г | 9000 г |
| Воды для инъекций | 1000 мл | 1000000 мл |
| Количество ампул | 100 шт | 100000 шт |
Номинальный объем заполнения ампул—10 мл.
Фактический объем—10,5 мл.
Соответственно состав на 1 000 л:
Натрия хлорида 9 450г
Воды для инъекций 1 050 000 мл
Количество ампул 100 000 шт.
Материальные потери на различных стадиях производства:
Приготовление раствора 0,15%
Ампулирование0,25%
Стерилизация0,30%
Контроль качества0,50%
Этикетирование0,10%
Материальные потери на каждой стадии можно рассчитать по следующей формуле:
W = mо × и, где
W — материальные потери на данной стадии;
mо — масса вещества в начале стадии;
и — потери в долях от единицы.
Результаты расчетов приведены в таблице.
Таблица 5. Материальные потери
| Ингридиенты | Взято | Получено | Потери |
| ТП 1 Приготовление раствора | |||
| Натрия хлорид | 9450 | 9435,82 | 14,18 |
| Вода для инъекций | 1050000 | 1048425 | 1575 |
| ТП 2 Ампулирование | |||
| Натрия хлорид | 9435,82 | 9412,23 | 23,59 |
| Вода для инъекций | 1048425 | 1045803,94 | 2621,06 |
| Ампулы | 100000 | 99750 | 250 |
| ТП 3 Стерилизация раствора | |||
| Натрия хлорид | 9412,23 | 9383,99 | 28,24 |
| Вода для инъекций | 1045803,94 | 1042666,53 | 3137,41 |
| Ампулы | 99750 | 99450,75 | 299,25 |
| ТП 4 Контроль качества | |||
| Натрия хлорид | 9383,99 | 9337,07 | 46,92 |
| Вода для инъекций | 1042666,53 | 1037453,2 | 5213,33 |
| Ампулы | 99450,75 | 98953,5 | 497,25 |
| ТП 5 Этикетирование | |||
| Натрия хлорид | 9337,07 | 9327,73 | 9,34 |
| Вода для инъекций | 1037453,2 | 1036415,75 | 1037,45 |
| Ампулы | 98953,5 | 98854,55 | 98,95 |
Уравнение материального баланса:
mн=mк+mп,
где mн—масса исходного продукта; mк—масса конечного продукта; mп—масса потерь.
Технологический выход:
η= mк /mн ∙ 100%
Технологическая трата:
Ε= mп/ mн ∙ 100%
Расходный коэффициент:
κ = mн /mк
Уравнение материального баланса для натрия хлорида:
9450=9327,73+122,27
η =9327,73/9450 ∙ 100%=98,71%
Ε=122,27/9450 ∙ 100%=1,29%
Κ=9450/9327,73=1,013
Уравнение материального баланса для воды для инъекций:
1050000=1036415,75+13584,25
η =1036415,75/1050000 ∙ 100%=98,71%
Ε=13584,25/1050000 ∙ 100%=1,29%
Κ=1050000/1036415,75=1,013
Уравнение материального баланса для ампул:
100000=98854,55+1145,45
η =98854,55/100000 ∙ 100%=98,85%
Ε=1145,45/100000 ∙ 100%=1,15%
Κ=100000/98854,55=1,012
Расходная пропись:
Натрия хлорида 9450 ∙ 1,013=9572,82 г