Инозиновая кислота (стр. 2 из 3)

Ідентифікація інозинової кислоти

Інозинова кислота дає кольорові реакції на рибозу, пуринову основу та органічний фосфор (фосфорну кислоту).

1.) Реакція рибози (пентоз) з орцином. До досліджуваного розчину добавляють рівний об’єм концентрованої соляної кислоти, декілька крапель розчину орцину і декілька крапель розчину, що містить іони Fe^3+, після чого нагрівають реакційну суміш в киплячий водяній бані на протязі 15-20 хв. Механізм реакції пов'язаний з дегідратацією пентоз з утворенням фурфурола, який дає зелене забарвлення при конденсації з орцином:

2.) Реакція з дифеніламіном (рибоза). До досліджуваного розчину добавляють трьохкратний об’єм 1% розчину дифеніламіну, після чого нагрівають на в киплячий водяній бані на протязі 15 – 20хв. Якщо в розчині наявна рибоза, то розчин забарвлюється в зелений колір. Механізм реакції пов’язаний з гідролізом нуклеїнових кислот при тривалому нагріванні. Отримані при гідролізі пентози утворюють забарвлені комплекси з дифеніламіном.

3.) Срібна проба (на пуринові основи, гіпоксантин). До досліджуваного розчину добавляють рівний об’єм 2% аміачного розчину AgNO₃, потім концентрований аміак до лужної реакції (можна перевірити за допомогою індикаторного папірця). Якщо в розчині присутні пуринові основи, то через 5хв випадає рихлий осад срібних сполук пуринових основ, які мають світло-коричневе забарвлення.

Світло-коричневий колір

4.) Молібденова проба на фосфорну кислоту

В пробірку вносять 5 крапель реактиву, що містить фосфорну кислоту, добавляють 10-20 крапель молібденового реактиву і кип’ятять на протязі декількох хвилин. При охолодженні пробірки під струєю води випадає кристалічний осад фосфорної солі молібдаду амонію лимонно – жовтого кольору:

12(NH₄)₂MoO₄ + H₃PO₄ + 21HNO₃ (NH₄)₃PO₄*12MoO₃*6H₂O + 6H₂O + 21NH₄NO₃

лимонно-жовтий колір

Приготування молібденового реактиву: в 100мл дистильованої води розчиняють 7,5 г молібдату амонію і додають 100ил 32%-го розчину HNO₃ щільністю 1,2 г/см3.

Кількісне визначення інозинової кислоти

1.) Спектрофотометричне визначення інозинової кислоти

Методи кількісного визначення нуклеїнових кислот, зокрема інозинової кислоти, засновані на спектрофотометрії в ультрафіолетовій області спектру, відрізняються високою чутливістю і простотою проведення аналізу. Інозинова кислота має максимум поглинання в ультрафіолетовому світлі при 249-250 ммк (в кислому середовищі). Коефіцієнт молярної екстензії інозинової кислоти при рН 2 і 250ммк ε = 10 900.

Необхідним етапом різних методів спектрофотометричного визначення нуклеїнових кислот являється їх екстракція із біологічного матеріалу разом з гідролізом полінуклеотидів. В зв’язку з цим слід мати на увазі, що із досліджуваного матеріалу попередньо необхідно видалити вільні нуклеотиди. В основі модифікації спектрофотометричного метода визначення вмісту нуклеїнових кислот, розробленим А.С. Спіріним, лежить екстракція їх із біологічного матеріалу гарячою хлорною кислотою з послідуючим визначенням поглинання екстрактів в ультрафіолетовій області спектру при 270 і 290 нм.

Реактиви:
1. НСlO₄ — 0,2 н. і 0,5 н. розчини.

Здрібнену на холоді наважку тканини (100 – 200мг) поміщують в центрифужну пробірку з 5-10 мл охолодженого 0,2 н розчину хлорної кислоти. Вміст пробірки ретельно перемішують, осад відділяють центрифугуванням на холоді (3000 об/хв, 10 хв). Центрифугат відкидають і осад повторно відмивають хлорною кислотою. Така попередня обробка матеріалу необхідна для видалення кислото розчинних нуклеотидів.

Після видалення центрифуга та до осаду добавляють 5—10 мл 0,5 н. розчину НС1О₄ і, закриваючи пробірки пробками з повітряним холодильником, нагрівають їх в кип’ячий водяній бані на протязі 30хв. Ця процедура забезпечує кількісну екстракцію нуклеїнових кислот з досліджуваного матеріалу і їх кислотний гідроліз до розчинних фрагментів. Гідролізати охолоджують і центрифугують. Осад піддають повторній екстракції 0,5 н. НС1О₄. Гідролізати поєднують і визначають поглинання на спектрофотометрі при 270 і 290 нм против контрольного розчину — 0,5 н. розчину НС1О₄. при необхідності гідролізати розводять тим же розчином.

Розраховують вміст фосфору нуклеїнових кислот в 1мл досліджуваного розчину за формулою:

C_мкгФ_н = (А270-А290)/0,19

Де 0,19 — значення (дельта)А (А270—А290), яке має гідролізат нуклеїнових кислот, що вміщує 1 мкг нуклеїнового фосфору в 1мл розчину.

При подальших розрахунках враховують загальний об’єм гідролізату і розчинення. Для перерахунку кількості нуклеїнового фосфору на кількість нуклеїнових кислот (інозинової кислоти) користуються середнім перерахунковим коефіцієнтом, що = 10,3.

С_мкг (інозинової кислоти) = С_мкгФ_н *10,3

Рекомендовано проводити додаткове визначення оптичної густини при 260 нм; оптична густина при 260 и 270 нм не повинна розрізнятися більш ніж на 15%.

2.) Визначення загального фосфору

Загальним фосфором (Ф_заг) називають весь фосфор, що міститься в даній пробі, тобто суму неорганічного фосфату (Ф_н) і фосфору, що входить до складу органічних сполук (Ф_орг). Для визначення (Ф_заг) досліджуваний розчин або тканину спалюють (мінералізують), нагріваючи з концентрованою сульфатною кислотою в присутності різноманітних окисників (Н₂О₂, КМnО₄). Найбільш широко використовують пергідроль ( (30%-вий розчин перекису водню). Н₂О₂ при нагріванні легко розкладається і не заважає колориметричному визначенню фосфату

Рективи:
1. H₂SO₄ — концентрована.

2. NaOH — 0,5 н. и 5 н. розчини.

3. Пергідроль.

4. Фенолфталеїн — 0,5%-ний спиртовий розчин.

Мінералізація. Кількість взятого на мінералізацію розчину залежить від вмісту в фосфоровмісній органічній сполуці фосфату, що аналізується і від чутливості використовуваного для визначення фосфату методу.

При визначенні неорганічного фосфату методом Фіске – Суббароу, який буде розглянутий нижче, на мінералізацію беруть таку кількість досліджуваного розчину, щоб в 1мл отриманого після мінералізації і нейтралізації розчину, вміщувалось від 0,2 до 1,0 мкмоль фосфату. 1—2 мл взятого на аналіз розчину поміщують в невелику колбу для спалювання (колба К’єльдаля) або жаростійку пробірку, добавляють 0,3 мл концентрованої сірчаної кислоти і зафіксувавши колбу (пробірку) злегка під нахилом, обережно нагрівають розчин на горілці, піщаній бані або на спеціальній електричній плитці до тих пір, поки майже повністю випарується вода і розчин в колбі набуде бурого забарвлення (якщо органічної речовини в пробі мало охолоджують, добавляють 2 – 3 краплини пергідролю і розчин знову нагрівають на протязі 5—10 хв. Якщо розчин при цьому побуріє, добавляють нову порцію пергідролю. При додаванні пергідролю треба слідкувати за тим, щоб він попав до розчину а не на стінки колби чи пробірки. Нагрівання при мінералізації не повинне бути занадто сильним, не можна допускати щоб важкі білі пари H₂SO₄ і оксиду сірки виходили з колби, так як разом з ними може частково вилітати і фосфат, що аналізується. Рекомендується проводити мінералізацію у колбах, прикритих скляними втулками або маленькими воронками, які вставляють, коли вода практично вся випариться. Одночасно з пробами, що аналізуються, мінералізацію проводять в контрольній «сліпій» пробі, що містить замість досліджуваного розчину воду. Необхідність контролю обумовлена тим, що реактиви, що використовуються при мінералізації, можуть містити залишки фосфорної, а також кременевої кислоти, наявність яких може зависити результати при визначенні загального фосфору. При розрахунку вмісту фосфату в досліджуваному зразку враховують величину оптичної щільності «сліпої» проби. Якщо значення оптичної щільності велика, реактиви варто змінити.
Визначення фосфору. По закінченню мінералізації вміст колби кількісно переносять в мірну колбу на 25 мл або в мірну пробірку у на 10 мл, додаючи невеликими порціями воду і ретельно споліскуючи колбу К’єльдаля. Першу порцію води в колбу слід додавати дуже обережно, так як при цьому відбувається сильне нагрівання розчину і створюються умови для гідролізу пірофосфату, який може утворюватися в процесі мінералізації при тривалому нагріванні фосфату з концентрованою сірчаною кислотою. В мірну колбу чи пробірку, заповнену приблизно наполовину розбавленим мінералізатом, додають 1 – 2 краплини фенолфталеїну і нейтралізують кислоту спочатку 5 н., а потім 0,5 н. розчином лугу до слабко рожевого забарвлення, доводять до риски водою і перемішують. З кожної колби відбирають по дві паралельні проби і проводять визначення неорганічного фосфату.

3.) Метод Фіске - Суббароу

Метод дозволяє визначити від 0,2 до 2 мкмоль неорганічного фосфату в пробі. В якості відновника в цьому методі використовують систему ейконоген (а-1,2,4-аминонафтолсульфонова кислота)-сульфіт, кислотність 0,75 н.