В.Н. Карнацхов (1994) считает, что в условиях сельского хозяйства консервация геномов позволит сохранять материал в течение десятилетий в неизменном виде, использовать и транспортировать его на далекие расстояния
Основные задачи, стоящие при консервации геномов - выбор способов сохранения. Очевидно, материал, избранный для консервации должен содержать генетическую информацию особи в наиболее полном виде. Этой задаче в наибольшей степени отвечают половые клетки – яйцеклетки и сперматозоиды, самой природой предназначенные для передачи генетической информации от поколения к поколению, а также зародыши (Брегма, Найденко, 1992). Однако можно себе представить такую ситуацию, когда мы имеем дело с последними представителями исчезающего вида животных, которые в силу каких-либо причин не могут быть источниками получения половых клеток: например, эти животные слишком стары или получение половых клеток сопряжено с опасностью для их здоровья. В этом случае необходимо сохранить любые доступные клетки тела - так называемые соматические клетки - например, клетки кожи или крови. К сожалению, не у всех животных соматические клетки являются генетически полноценными. Так, у некоторых насекомых, червей часть генетического материала выбрасывается из таких клеток в ходе раннего развития - происходит так называемая диминуация хроматина. Это было показано опытами американских ученых Роберта Бриггса и Томаса Кинга, впервые опубликованными в. 1952 г и выполненными на лягушке. Позднее такие опыты проводили на многих животных в ряде стран, в том числе и в СССР. Здесь ядро яйцеклетки удаляет и заменяет ядром соматической клетки. В ряде случаев развитие такой яйцеклетки привело к образованию взрослого полноценного животного, даже когда ядра были взяты из кожи взрослых животных. Следовательно, соматические клетки также могут быть использованы как материал для консервации генома (Лозино-Лозинский, 1972).
В природе известны случаи, когда клетки остаются живыми и неизменными в течение многих месяцев или даже лет. Примером такой «физиологической консервации» является так называемая диапауза – временная остановка развития зародыша. Так, в половых путях самок многих видов млекопитающих зародыши находятся почти в неизменном состоянии в течение многих месяцев. У некоторых карпозубых рыб живущих в Пересыхающих водоемах Африки, зародыши останавливаются на ранних стадиях развития и в таком виде переживают неблагоприятное для них сухое время года. У многих бабочек, в том числе тутового шелкопряда, развитие зародыша в яйце останавливается на всю зиму. У других бабочек зимуют куколки. Широко распространенное явление зимней спячки млекопитающих также можно рассматривать как пример физиологической консервации, так как жизненные процессы при этом сведены до минимума. Двоякодышащая рыба протоптерус живет в пересыхающих водоемах Африки. В период засухи протоптерус окружает себя коконом из слизи. В таком состоянии он может просуществовать до 4 лет. Физиологическая консервация достигается и искусственным путем. Однако до сих пор не удалось искусственно воспроизвести условия, обеспечивающие без глубокого замораживания столь длительное сохранение спермиев вне организма. Спермии сохраняют жизнеспособность при температуре 13°С не более 35 недель (Карамарова и др., 1994).
Представляется очень привлекательным выяснить физико-химические и биохимические механизмы физиологической консервации и создать на этой основе искусственные среды для хранения клеток в течение относительно короткого времени: дней, месяцев, нескольких лет. Во многих случаях для практических задач и фундаментальных исследований эти сроки хранения клеток достаточны (Осташко, 1978).
Наиболее перспективным способом консервации геномов является глубокое замораживание. В настоящее время глубокое замораживание клеток, тканей и органов получило широкое распространение в медицине и сельском хозяйстве. Этому предшествовали исследования устойчивости живых организмов к действию низких температур и изменений, происходящих в клетке при консервации (Гахова, 1994).
Охлаждение живых клеток ниже 0°С сопровождается вымораживанием воды в клетке, в результате чего в несколько раз увеличивается концентрация растворенных солей, меняется рН, образуются кристаллы льда, возникают механические напряжения, повреждающие клетку. Эти процессы нарушают работу клеточных структур встроенных в мембраны, которые обеспечивают клетку энергией, поддерживают нормальные для клетки концентрации ионов и транспорт веществ между клеткой и средой. Различные виды растений и животных по разному переносят снижение температуры. Самыми холодоустойчивыми оказались организмы, выдерживающие значительное обезвоживание: простейшие в виде цист, коловратки, тихоходки, черви (нематоды). Опыты французского ученого Беккереля, проведенные еще в начале нашего века, показали, что эти организмы остаются живыми при глубоком замораживании, когда температура их тела приближается к абсолютному нулю (-273°С). Другие виды также переносят значительное охлаждение, несмотря на большое содержание воды в их тканях. Например, не погибают моллюски и ракообразные, живущие в прибрежной полосе северных морей и регулярно вмерзающие зимой в лед. Выдерживают замораживание жуки-плавунцы, личинки комара-звонца, рыба далия, живущая на Чукотке, куколки некоторых бабочек и многие другие виды холоднокровных животных (Курбатов и др., 1988).
Исследования показали, что все эти организмы, во-первых, способны выдерживать переохлаждение, при котором не происходит образования льда, хотя температура их тела опускается иногда на десятки градусов ниже точки замерзания жидкостей организма. Во-вторых, их клетки содержат вещества, понижающие точку замерзания: глицерин, особые белки, сахара, Например, жук-древоточец зимой содержит в своем теле до 25% глицерина. В-третьих, у животных, которые регулярно подвергаются опасности замерзания, развита способность к восстановлению клеточных структур, повреждающихся при образовании льда (там же).
Исследователи, занимающиеся поисками путей сохранения клеток при низких температурах, идут по второму пути. Они вводят в среды, где происходит замораживание, вещества, называемые криопротекторами, которые снижают точку замерзания, связывают внутриклеточную воду и защищают структуры клетки от разрушения. К ним относятся: глицерин, диметилсульфоксид, полиэтиленгликоль. Еще лучшими криозащитными свойствами обладают смеси криопротекторов с веществами, стабилизирующими клеточные мембраны. В качестве таких веществ используют яичный желток, антиоксиданты, некоторые сахара (Андреев, Петропавлов, 1994).
При существующей сегодня технологии можно успешно замораживать спермии, гонады и многие соматические клетки, в частности лимфоциты. Электронно-микроскопические исследования указывают на хорошую сохранность клеточных структур глубокозамороженных клеток. Это дает основания уже сегодня ставить вопрос о создании банков глубокозамороженных клеток (Вепринцев, Ротт, 1984).
Глубокое замораживание сперматозоидов - одна из наиболее разработанных отраслей криобиологии (Цветкова и др., 2000). Это связано как с биологическими особенностями спермиев, делающими их наиболее подходящим объектом для замораживания, так и с большим практическим значением этих работ. Успешная разработка глубокого замораживание сперматозоидов дает возможность:
1) сохранять и использовать сперму производителей, дающих высоко-качественное потомство в течение длительного времени, превышающего продолжительность жизни самих производителей;
2) транспортировать сперму таких производителей в отдаленные районы, совершенствуя таким образом животноводство в этих районах;
3) создать банк генов малоиспользуемых пород, особенно местных, представляющих ценный материал для создания новых пород;
4) создать банк генов редких и исчезающих видов (Карнаухов, 1994).
Спермии являются наиболее подходящим для глубокого замораживания видом клеток, так как генетический материал в них плотно упакован, содержание воды, с замерзанием которой связано основное повреждение клетки, мало, и уровень жизнедеятельности в неподвижном состоянии низок (Грищенко, и др., 1994).
Первые попытки замораживания спермы сельскохозяйственных животных принадлежат выдающемуся русскому биологу И.И.Иванову, который в 1907г. показал, что спермии жеребца после охлаждения до -15°С восстанавливали оплодотворяющую способность. В 1947 г. Н.И. Соколовская, В.К. Милованов и И.В.Смирнов получили потомство от осеменения самок оттаянной спермой кролика, хранившейся при температуре твердой углекислоты (-78°С). Принципиальное значение имела работа Смит и Полджа, которые в 1949г. стали использовать для замораживания среду с глицерином при температуре жидкого азота (-196°С), которая в основном и используется в настоящее время. Применение глицерина положило начало использованию криопротекторов. К настоящему времени опыты по замораживанию спермиев проведены на млекопитающих, птицах, пресмыкающихся, земноводных, моллюсках - всего более сотни видов. У большинства из них спермии после оттаивания восстанавливают подвижность. На 16 видах млекопитающих, 5 видах птиц, 1 виде земноводных, 15 видах рыб, 6 видах иглокожих, 2 видах моллюсков показано сохранение оплодотворяющей способности спермиев после замораживания и оттаивания (Савушкина, 1999).