Рис.6.Гидроксилирование бензольного кольца. Упрощенная схема микробной деструкции нафталина
Таким образом простые ПАУ должны разлагаться микроорганизмами гораздо быстрее чем такие ПАУ как пирен, хризен, 3,4бензпирен и другие. В соответствии с правилом последовательного окисления только одного ароматического кольца при деструкции смеси ПАУ должно происходить накопление полиядерных веществ, разрушение которых требует длительных сроков инкубации. Правило последовательного окисления действует для различных видов микроорганизмов.
5.Цели и задачи исследования
Целью работы является изучение процессов биодеградации смеси вредных ПАУ микроорганизмами, разрушающими древесину и создание на их основе высокоэффективных штаммов-деструкторов указанных соединений.
Задачи исследования сводятся к:
1)Поиску в коллекциях и выделению из природных биоценозов микроорганизмов-деструкторов вредных веществ и отбор наиболее активных штаммов;
2)Адаптации штаммов к условиям культивирования (масштабирование процесса);
3)Изучению процессов разрушения многокомпонентной смеси ПАУ в условиях твердофазной ферментации;
4)Изучению фотолиза ПАУ.
6.Патентный поиск
Поиск патентной информации проводился на базе фундаментальной библиотеки СПбГТИ(ТУ), объединенной библиотеки ВИЗР и ВНИИСХМ, библиотеки АН, а также Российской Национальной библиотеки. Поиск осуществлялся по следующим направлениям: штаммы-деструкторы ароматических экотоксикантов, питательные смеси для очистки загрязненных почв, аппаратурное оформление процессов компостирования твердых отходов, методы предобработки отходов. По данным направлениям обнаружена следующая инормация:
1.Штамм актиномицетов Streptomyces rochei, осуществляющий полное разложение 2,4,6-трихлорфенола или 2,4-дихлорфенола или 2,6- дихлорфенола, или 2-хлорфенола: А.с. 1652335 СССР, МКИ5 С12 N 1/20, С12 S 13/00/ Головлева Л.А., Заборина О.Е., Перцова Р.Н., Евтушенко Л.И.; Ин-т биохимии и физиол. микроорганизмов АН СССР.- № 4696431; Заявл. 08.06.89; Опубл. 30.05.91, Бюл. № 20.
2.Методы и установка для [проведения] аэробного ферментативного, в частности, для компостирования органических материалов. Verfahren und Vorrichtung zur aeroben, fermentativen Hydrolyese, insbesondere zur Kompostierung vor organischen Stoffen: Заявка 3925905 ФРГ, МКИ5 С12М 1/02, СО5F 9/04/ Hofmann Hermann, Schnorr Karl Ersnt.-№ 3925905.6; Заявл. 04.08.89; Опубл. 28.02.91.
3.Фотолитически усиленное микробное разрушение [веществ] загрязняющих окружающую среду. Photochemically enhanced microbial degradation of enviromental pollutants: Пат. 5342779 США МКИ5 ВО9В 3/00, D06Н 16/00/ Matsumura Fumio, Katayama Arata; The Regents of the University of California.- №687368; Заявл.18.04.91; Опубл. 30.08.94; НКИ 453/262.5.
4.Улучшенная смесь питательных соединений для биологической очистки загрязненых почв и вод. Verbesserte Nahrstoffgemische fur die Bioremediation verschmutzter Boden und Cewasser: Заявка 4228168 ФРГ, МКИ5 С12N 1/26, С12S 9/00/ Kopp-Holtwiesche Bettinna, Weiss Albricht; Henkel KGaA.-№ 4228168.7; Заявл. 25.08.92; Опубл. 03.03.94.
5.Штамм бактерий - деструктор фенола, бензола и их галогензамещенных аналогов: Пат. 2041943 Россия, МКИ6 C12N 1/12, CO2F 3/34/ Зайцев Г.М., Ивойлов В.С; Суровцева Э.Г.; Науч.-произв. предприятие Биотехинвест. - №92014789/13; Заявл. 28.12.92; Опубл. 20.08.95, Бюл. № 23.
7.Экспериментальная часть
7.1.Материалы и методы
7.1.1.Материалы
7.1.1.1.Штаммы микроорганизмов
В нашей работе были использованы штаммы мицеллиальных грибов любезно предоставленные Ю.С.Оследкиным (ВНИИСХМ, г.Пушкин).
В таблице №1 приводится список видов и номера штаммов, а также указывается доступная информация об источнике их происхождения (организации и/или географическом и/или экологическом происхождении).
таблица 1
| №п/.п | название штамма | коллекционный/ музейный номер штамма | источник |
| 1 | Trichoderma linorum | 32 | ARRIAМ |
| 2 | Trichoderma linorum | 37 | ARRIAM |
| 3 | Trichoderma linorum | 48 | ARRIAM |
| 4 | Chaetomium elatum Kunze:Fris 1817 | 341 | СПбГУ |
| 5 | Chaetomium bainieri Munk 1957 | 344 | СПбГУ |
| 6 | Chaetomium funicolum Cooke 1873 | 347 | СПбГУ |
| 7 | Chaetomium coclioides Palliser 1910 | 491 | Укр.ИСХМ |
| 9 | Coriolus versicolor (L.1753:Fr. 1821) Quelet 1888 | 330 | ВИЗР |
| 10 | Fusarium solani (Martius) Sacc 1881 | 464 | Ленинград- ский рег., почва |
| 11 | Fusarium solani (Martius) Sacc 1881 | 496 | РФ, почва |
| 12 | Phanerochaete chrysosporium | F-20696 | ATCC |
7.1.1.2.Питательные среды
В работе были использованы следующие питательные среды:
1.Среда Ван-Итерсона /41/, г/л:
NH4NO3 -0,5
KH2PO4 -0,5
полоска фильтровальной бумаги -1x12 см
H2O -1 литр
2.Среда Ван-Итерсона модифицированная /42/:
минеральный состав среды тот же, что и в классическом варианте, полоска фильтровальной бумаги инпрегнированна веществом, для которого отбирается штамм-деструктор содержание вещества составляет 5% от массы полоски бумаги
3.Среда Чапека /41/, г:
KH2PO4 -1,0
NaNO3 -3,0
KCl -0,5
MgSO4.7H2O -0,5
FeSO4.7H2O -0,01
H2O -1 литр
4.Среда Чапека с сахарозой/41/:
Минеральный состав без изменений, добалено 30 г/литр сахарозы
5.Сусло пивное неохмеленное /41/:
Неохмеленное пивное сусло разводится в два раза водопроводной водой и стерилизуется
Для получения твердых питательных сред добавляли 2 г/литр агар-агара.
7.1.1.3.Субстраты
Для выделения, отбора, хранения и культивирования микромицетов использовали следующие субстраты (табл.2.):
таблица 2
| № п.п. | наименование субстрата | источник получения | применение |
| 1 | бумага фильтровальная | Whatman No 1 Великобритания | выделение микромицетов |
| 2 | березовые опилки | Столярная мастерская СПбГТИ(ТУ) | культивирование микромицетов |
| 3 | древесина шпал | Пропиточный з-д. г.Отрадное | культивирование микромицетов |
7.1.1.4.Пробы
В работе были использованы образцы древесины телеграфных столбов, подвергшихся воздействию микроорганизмов (Новгородский регион), любезно предоставленныe Марьяновской Юлией Валентиновной (кафедра МБТ СПбГТИ(ТУ)).
7.1.2.Методы
7.1.2.1.Выделение культур микромицетов
Выделение первичных культур велось на модифицированной среде Ван-Итерсона. Для устранения посторонних микроорганизмов образец короткое время обжигали в пламени спиртовки и помещали на питательную среду. Микроорганизмы, находящиеся на поверхности, гибли, а те микробы, которые находились внутри образца сохраняли жизнеспособность. Продолжительность инкубации составляла 60 суток. Остальные условия оговариваются особо.
Выделение чистых культур велось на агаре Чапека с использованием стандартных микробиологических методов /43/.
7.1.2.2.Изучение морфологических и физиолого-биохимических свойств культур микромицетов
Для изучения морфологических, культуральных и физиолого-биохимических свойств культур микромицетов использовали стандартные микробиологические среды и методы /41/.
Цитоморфологические наблюдения проводили с помощью общепринятых методов и растворов красителей /41/.
7.1.2.3.Отбор штаммов-деструкторов ПАУ
Отбор целлюлолитических штаммов мицеллиальных грибов оcуществляли на среде Чапека c целлюлозой и ПАУ (содержание ПАУ 5% от массы целлюлозного субстрата). Оценка роста производилась визуально.
7.1.2.4.Твердофазное культивирование микроорганизмов
Культивирование мицелиальных грибов в твердой фазе проводили в кюветах емкостью 0,5 л и бутылях емкостью 30 л.
Содержание среды в кюветах-250 г, в бутылях-2,5 кг. Перемешивание осуществляли вручную: в кюветах-шпателем, в бутылях встряхиванием. Периодичность перемешивания и остальные условия оговариваются особо.
Культивирование мицеллиальных грибов проводилось на специально разработанных средах, представляющих собой измельченную древесину, инпрегнированную ароматическими веществами и увлажненную раствором солей и сахаров. Объем увлажняющей жидкости составлял 200-400 мл на 1 кг древесины.
Посевной материал для кювет выращивали на чашках Петри на тех же средах. Чашки Петри засевали суспензией спор, полученной путем смыва увлажняющей жидкостью с газона 7-суточной культуры на агаре Чапека. Для засева бутылей использовали содержимое кювет, во всех случаях посевной материал вносился в количестве 10% от объема ферментационной среды.
7.1.2.5.Фотолитическая обработка субстратов
Субстраты помещали в кюветы, которые располагались под источником излучения на расстоянии 50-60 см. Чтобы избежать перегрева поверхности субстрата, лампа работала периодически, не более 4 часов в течении рабочего дня.
В качестве источника излучения использовали газоразрядную лампу ПРК-7 (lmax=257,3 нм).