В спиральном димере N-конец к N-концу каждый мономер стабилизирован 12-ю внутимолекулярными водородными связями, а димер – 6-ю межмолекулярными водородными связями, в образованиии которых принимают участие N-концевые формильные группы. Предложенно, что открывание и закрывание канала связанно с ассоциацией и диссоциацией ( то есть с образованием и разрывом межмолекулярных водородных связей) такого ддимера [37] (РИС).
Рисунок 3.
Схематическое изображение инактивации грамицидинового канала путем диссоциации димера голова к голове (структура Урри – Арсеньева).
Изучения аналогов грамицидина показали, что N-коцевая формильная группа оказывает сильное влияние на стабильность димера [38]. При ее замещении на более объемную ацетильную [39], сукцинильную [40] или при отсутствии вообще время жизни канала уменьшается. Исследования методом КД-спектроскопии показали сильные конформационные различия между нативным грамицидином и его аналогами, что, возможно является причиной дестабилизации канала [41].
Дальнейшие исследования с помощью 13С- и 15N-меченных аналогов в ориентированных мультиламелярных бислоях показали возможность существования праозакрученной конформации канала [24].
Наиболее детальная структурная конформация грамицидина была определенна методом двумерного ЯМР в комплексе грамицидина с додецилсульфатом натрия (Арсеньев и сотр. 1985 г.). Данная структура представляет собой спиральный димер, в котором каждая составляющая спираль имеет 6,3 остатка на виток (b6,3-спиральный димер) (Рис.4.)
Рисунок 4.
СРК Изображение правозакрученного спирального димера грамицидина с 6,3 остатка на виток (PDB Code: 1GRM). A – вид сверху; Б – вид сбоку. Две молекулы грамицидина в димере показанны разными цветами. Водороды скрыты.
. Дальнейшие исследования показали что одна пара остатков Trp (9Trp и 15Trp ) могут находиться в стэкинг взаимодействиях [41]. Более того, теоретические расчеты показали, что наиболее энергетически выгодной структурой в мембране является именно b6,3-спиральный димер, в котором остатки триптофана образуют кластеры на границе раздела фазы липид-вода, и их азоты индoльных групп способны взаимодействовать с полярными головками липидов и с молекулами воды. В двухспиральной конформации остатки триптофана расположенны равномерно по внеешней поверхности спирали и только два из них (в отличие от четырех в b6,3спиральном димере) могут взаимодействовать с молекулами липидов или водой. Таким образом, двухспиральная конформация энергетически дестабилизиированна в мембране по отношению к спиральному димеру [41] (рис.5).
А Б В
Рисунок 5 Положение боковых радикалов остатков триптофана в различных конформерах грамицидина. Вид сбоку.
Боковые радикалы триптофанов выделенны синим цветом. А – β6,3-спиральный димер (Структура Урри-Арсеньева, наблюдаемая в мембранах); Б – ββ5,6-двухспиральный димер (Структура Витча, наблюдаемая в органических растворителях); С – β7,2-двухспиральный димер (структура комплекса грамицидина с ионом цезия в органических растворителях и кристаллах)
Спектроскопические исследования грамицидина в различных мембранах показали, что соотношение спиральных и двухспиральных димеров является функцией степени ненасыщенности липидов, образующих мембрану. При увеличении доли ненасыщенных липидов увеличивается доля двухспиральной конформации. Эти результаты говорят о том, что боковые цепи триптофанов могут взаимодействовать с С=С связями [42]. Модельные исследования в кобинации с экспериметами по изучению липид – пептидных взаимодействий так же подтверждают важность этих аминокислот для стабилизации канальной структуры и оказывают влияние на организацию окружающих грамицидин липидов [ 17]
В результате (в 90% случаев) грамицидин образуе активный трансмембранный канал одной единственной структуры, являющейся b6,3-спиральным димером. Эта структура аналогична модели предложенной ранее Урри [12].
2.5.Влияние связывания ионов на конформацию грамицидина
Грамицидин способен транспортировать одновалентные катионы через фосфолипидные мембраны [43].Его разная селективность по отношению к различным представителям группы щелочных металов определяется как размером конкретного иона, так и значением его энергии гидратации. Относительные константы афинности с натрием, калием, рубидием, цезием и талием были исследованны с помощью метода регистрации одиночных каналов [44], изучения аналогов грамицидина [45],равновесного диализа [46], ЯМР [47], проводимости воды [48] и показали, что константа связывания талия на порядок меньше чем цезия и на два порядка меньше чем натрия. Дальнейшие исследования показали, что с каналом одновременно могут связываться два иона, причем константа связывания первого катиона больше чем второго [49], что видимо, связано с электростатическим отталкиванием.
Двухвалентные катионы блокируют проведение одновалентных [39] и нетранспортируются грамицидиновым каналом. Последние исследования [49] показали, что частично дегидратированный двухвалентный катион связыватся с грамицидином с большей энтальпией чем одновалентный. Таоке сильное взаимодействие является следствием низкой подвижности двухвалентных катионов в грамицидиновом канале.
Связывание анионов с грамицидиновым каналом не было продемонстрированно, хотя существуют некоторые доказательства их проводимости и влияния на транспорт катионов [44].
Взаимодеиствие грамицидина с одновалентными катионами оказывает слабое влияние (или вовсе не влияет) на форму его спектра КД [50], и, таким образом, на конформацию грамицидина.
Комплексы грамицидина с лизолецитином так же связывают катионы, они были использованны для определения констант связывания [51] и локализации сайтов связывания. В данной системе наблюдается изменение формы спектра КД при связывании катионов (в отличие от комплекса с додецилсульфатом натрия, где такой эффект отсутствует), что свидетельствует об изменении конформации при таком взаимодействии [52].
В органических растворителях наблюдается сильное изменение структуры грамицидина при связывании с катионом , что демонстрируется изменением как формы, так и амплитуды спектра КД.
При исследовании связывания цезия с грамицидином в растворе наблюдается постепенное изменение формы спектра КД, что свидетельствет о плавном переходе из формы свободного грамицидина в ион-связанною. Эти данные были использованны для определения констант связывания цезия, которые составили К1=170 М-1 – для первого (более крепкого )сайта, и К2=20 М-1 – для второго (более слабого ) сайта связывания. Константа связывания для лития, определенная тем же методом имеет величину на порядок меньшую, чем таковая для цезия [28]. Константа связывания для натрия была определенны методом 23Na ЯМР [53] и составила 4 М-1. Константы связывания других ионов не были определенны, в связи с их низкой аффинностью, что делает такие изимерения довольно сложными.
В растворе хлороформ-метанол в присутствии тиоцианата цезия грамицидин (по данным двумерной ЯМР-спектроскопии) представляет собой правозакрученную антипараллельную двойную спираль с 7,2 остатка на виток (b7,2-спиральный димер) и сдвигом в 1,5 остатка, что свидетельствует о том, что 1Val не участвует в образовании водородных связей [54] (рис.6). Кристаллические структуры грамицидина дают дополнительную информацию о его трехмерной структуре и, более того, возможность формирования кристаллов в отсутствии и в присутствии ионов позволяют изучить их влияние. Обе ионсвязанная и ионсвободная кристаллические структуры грамицидина являются левозакрученными антипараллельными двойными спиралями и отличаются от форм в растворе значениями углов f и y, направлением образования водородных связей и регулярностью укладки полипептидного остова. Ионсвободная кристаллическая форма длиннее (31 Ǻ) и уже (внутренняя полость довольно узкая и в некоторых местах не способна связывать ион) чем кристаллическая форма с тиоцианатом цезия (26 Ǻ в длину , 4,9 Ǻ – внутренний диаметр поры, в которой помещается ион цезия) [17].
А Б
.Рисунок 6.
СРК Изображение правозакрученного антипараллельного двухспирального димера грамицидина с 7,2 остатка на виток (ββ7,2 -двухспиральный димер) (PDB Code: 1AV2) в компелексе с цезием. А – вид сверху и ион цезия; Б – вид сбоку. Две молекулы грамицидина в димере показанны разными цветами (красный и синий).
Конформация полипептидного остова в ион-связанной форме грамицидина более упорядоченна, хотя и имеются некоторые вариации углов f и y в районах прилегающих к сайтам связывания катионов, а водородные связи направленны почти параллельно оси спрали [55]. Это говорит о том что данная спираль с большей вероятностью имее 6,4 остатка на виток, чем 7,2 .
Сравнение ион-свободных и ион-связанных форм грамицидина показало, что при связывании происходит переупаковка и адаптация трехмерной структуры под конкретный катион. Такая перестройка возможна при реорганизации водородных связей. Так же наблюдается локальное расширение спирали в местах связывания иона и реориентация карбонильных групп пептидного остова, участвующих в связывании ионов [17].
2.6.Локализация сайтов связывания катионов в различных конформациях грамицидина
Катион связывающие сайты в двухцепочечных структурах могут быть определенны непосредственно из их кристаллических структур в комплексе с хлоридом цезия [56]. Внутри поры находятся два иона цезия симметрично расположенных на растоянии ~7,2 Ǻ от конца спирали. Сайты связывания сформированны карбонильными группами полипептидного остова, которые, связывая ион ориентируются к оси спирали под углом ~40º. Угловое перераспределение карбонильных групп увеличивает дистанции между группами, образующими водородные связи, и таким образом изменяются значения углов f и ψ. Карбонильные группы на противоположных сторонах поры, пренадлежащие остаткам 11Trp и 14Leu, являются ближайшими к связанному катиону. В таких кристаллах помимо двух ионов цезия в комплексе с грамицидином так же находятся еще и три иона хлора, два из которых расположенны на противоположных концах спирали, а третий - в её центральной части. Ионы хлора отделены от цезия молекулами растворителя на растояние ~10 Ǻ. Наличие связанных ионов хлора довольно необычно, так как грамицидин не транспортирует анионы, а теоретические расчеты [57] показывают, что энергетический барьер связывания аниона значительно больше чем катиона (что делает вход в канал для аниона менее выгодным). Присутствие аниона внутри поры может быть вызвано высокой концентрацией соли в кристаллах и ионы хлора взаимодействуют с сайтами связывания подобно тому как это делают молекулы растворителя. В кристаллах с тиоцианатом цезия позиция иона цезия отличается от таковой в кристаллах с хлоридом цезия [55]. Исследования показали, что в этих кристаллах сайты связывания находятся ближе к концам спирали.