Структура грамицидинового канала, его фундаментальное и практическое значение (стр. 5 из 6)
2.9.Инженерия грамицидинового канала
Грамицидин в 90% случаев образует трансмембранный канал одной структуры, такая функциональная и химическая простота делает его уникальной моделью для изучения мембраноактивных пептидов и использования для понимания принципов пространственной организации и функционирования мембранных белков в общем и ионных каналов в частности.
Различные еденичные аминокислотные замены могут быть произведенны в грамиицидине без сильного эффекта на структуру и функцию канала [72], что позволяет проводить эксперименты по выяснению влияния конкретных аминокислотных остатков на свойства грамицидинового канала. Так же можноизучать влияние непротеиногенных (не кодируемых генетически) аминокислот [73].Более того некоторые изменения в первичной последовательности грамицидина дают каналы с качественно новыми функциями или конформациями [41].
Было показанно, что, изменяя первичную последовательность грамицидина, можно сдвигать конформационное равновесие в мембране, получая активные каналы, образованные приемущественно двухспиральными димерами. Так же, модификация первичной последовательности сильно влияет на электрофизиологические характеристики грамицидинового канала и дает возможность варьировать время жизни и проводимость канала[41].
Дальнейшие исследования различных аналогов грамицидина с измененной аминокислотной последовательностью открыли возможность получать потенциалзависимые грамицидиновые каналы. Существет два возможных пути получения каналов с такими свойствами. Первое: образование ассиметричных каналов (гетеродимеров), что влияет на энергетический профиль трансмембранного движения иона, делая его ассимметричным. Такая ассимметрия увеличивается при изменении первичной последовательности от центра канала к его входу (то есть от N- к C-концу молекулы грамицидина.
Вторым способом получения потенциалзависимого поведения грамицидинового канала является введение в его последовательность сенсора напряжения, только в данном случае эти сенсоры имеют намного меньшие размеры (одна аминокислота) чем в “больших” ионных каналах, а принцип их действия остается неизменным.
Вышеописанные исследования говорят с одной стороны о важности практически всех аминокислот, входящих в последовательность грамицидина (а не только остатков триптофана), и, с другой стороны открывают новые возможности для моделирования структуры и функции канала [41].
2.11.Общее применение в качестве модельной системы
Данные последних исследований методами дифракции ренгеновских лучей, ЯМР-, КД- и ИК – спектроскопии, а так же компьютерное моделирование и исследование химически модифицированных аналогов позволяют детально понять природу структуры грамицидинового канала и его конформационных переходов. Результатом использования такого широкого набора методов является возможность по-новому взглянуть на конформационные взамиоотношения в молекуле грамицидина и сравнить их с существующими моделями.
Оглядываясь назад, мы видим что все предложенные изначально конформационные модели являются корректными, отображают общие принципы упаковки полипептидного остова и не противоречат экспериментальным данным, что очень важно для применения в исследовании других молекул.
В качестве модели грамицидин был использован для изучения липид – белковых взаимодействий [77], ионной проводимости [78], влияния трехмерной структуры на функцию [17]. Но применять эту модель нужно очень осторожно, из-за маленьих размеров, молекула грамицидина очень подвижна и принмает множество конформаций в зависимости от внешних условий, в то время как “большие” ионные каналы, состоящие из длинных полипептидных цепей, а иногда и нескольких субъедениц, имеют довольно стабильную пространственную структуру в условиях, близких к физиологическим (или же имеют небольшие вариации прис охранении общего способа укладки полипептидной цепи). Таким образом, определяя еденичную трехмерную структуру “большого” канала мы с большой вероятностью можем сказать что эта конформация и представляет из себя активный канал.
Сначала было предположенно, что структурно функциональные отношения в грамицидине более просты для понимания, в связи с тем, что ионсвязывающие сайты образованны только карбонильными группами полипептидного остова, а не боковыми радикалами аминокислот, и было предположенно, что на связывание ионя влияет только конформация полипептидного остова. При более детальном исследованиии аналогов с измененной первичной последовательностью выяснилось, что даже находясь на внешней стороне канала и далеко от сайтов связывания боковые радикалы аминокислот оказывают сильное влияние на свойства проводимости и конформационной стабильности, что так же должно быть учтено в модельных исследованиях.
2.12.Практическое применение грамицидина
Помимо большого фундаментального значения молекулы грамицидина для понимания структурно-функциональных взаимоотношений в мембраноактивных белках, он так же нашел и практическое приминение, опять же основанно на каналобразующем свойстве этой молекулы. Приведем лишь два самых ярких примера такого использования. Превое: был разработан метод пэтч калмп регистрации с использованием грамицидин перфорированных мембран, что дает возможность изучать анион проводящие каналы (такие как GABA- и глициновые рецепторы) в условиях, не затрагивющих их функции [81]. Второе использование, основанное на современных достижениях органического синтеза относится к разряду молекулярных нанотехноогий и является создание на основе грамицидинового канала мембрансопряженного биосенсора [82]. Принцип действя такой наномашины основан на преобладающей структуре грамицидина в мембране (b6,3-спиральный димер). Основным элементом такого биосенсора является прикрепленная к электроду мембрана, в которую встроен грамицидин. Один из мономеров грамицидина закрепленн в нижнем слое мембраны и, таким образом является неподвижным. Вторая часть грамицидинового канала модифицирована “связывающим агентом” (антиген, антитело, лиганд) и свободно диффундирует в верхнем слое мембраны. При добавлении анализируемого раствора, и наличии в нем веществ имеющих сродство к “связывающему агенту”, происходит спецефическое взаимодействие, приводящее к инактивации грамицидинового канала. Таим образом, детекция наличия каких-либо веществ в анализируемогом растворе происходит путем измерения проводимости грамицидинового канала. Помимо большого практического применения данная система может иметь большое фундаментальное значение при понимании принципов передачи сигнала через мембрану (как это происходит например в рецепторах сопряженных с G-белками).
Рисунок 7. Схема мембрансвязанного биосенсора на основе грамицидинового канала. А – грамицидиновый канал открыт , спецефическое связывание отсутствует. В – произошло спецефическое связывание произошло, грамицидиновый канал закрылся. Мономеры грамицидинового канала показаны красным цветом; зеленым цветом показана спейсерная группа; коричневым цветом показан “связывающий агент”; синим цветом показан аналит, спецефически взаимодействующий со “связывающим агентом”.
Список литературы
1. Hotchkiss R.D., Dubos R.J. 1940, Journal of Biological Chemistry: v.132 p.791
2. Sarges R., Witkop B.,1964 Journal of American Chemical Society, vol.86, p.1862
3. Sarges R., Witkop B., 1965 Journal of American Chemical Society, vol 87, p.2011
4. Sarges R., Witkop B., 1965 Journal of American Chemical Society, vol 87, p.2027
5. Sarges R., Witkop B, 1965 Biochemistry, vol. 4, p.2491
6. Weinshtein S., Wallace B., et.al., 1980 Journal of Molecular Biology, vol 143, p1
7. Gross E., Witkop B., 1965 Biochemistry, vol. 4, p:2495
8. Koeppe R.E. II, Paczkovski J.A., Whaley W.L., 1985 Biochemistry, vol. 24, p.:2822
9. Gause G.F., Brazhnikova M.G., 1944 Lancet, vol. 247, p.:715
10. Veatch W.R., Fossel E.T., Boult E.R., 1974 Biochemistry, vol. 13, p.5249
11. Urry D.W., 1971 Proc Natl Acad Sci U S A, vol.68, p672
12. Ramachandran G.N., Chandrasekaran R, 1972 Ind. J. Biochem. Biophys., vol.9, p.1
13. Urry D.W., 1971 Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, vol 68, p.1907
14. Ramakrishnan G.N., Ramachandran G.N., 1965 Biophys. J., v.5, p909
15. Fossel E.T , Veatch W.R, Ovchinnikov Y.A., Buolt E.R., 1974 Biochemistry, vol.13, p5264
16. Veatch W.R, Boult E.R., 1974 Biochemistry, vol.13, p5257
17. Wallace B.A., 1990 Annu. Rev.Biophys. Biophys Chem., vol.19, p.127
18. Bystrov V.F., Arseniev A.S., 1988. Tetrahedron, vol.44, p.925
19. Langs D.A., 1988 Science, vol.241, p.188
20. Сычев С.В., Невская Н.А., Иорданов С., Мирошников А.И., Иванов В.Т. 1980, Биоорганическая химия, том 9, стр.121
21. Hawkes G.E., Lian L.-Y., Randall E.W. 1987, Eur. J. Biochem., vol.166, p. 437
22. Isbell B.E., Rice-Evans C, et.al. 1972 FEBS Lett., vol 25, p. 192
23. Killian J.A., Prasad K.U., et.al. 1988 Biochemistry, vol.27, p.4848
24. Wallace B.A., Veatch W.R., Boult E.R. 1981 Biochemistry, vol. 20., p. 5754
25. Weinstein S., Durkin J.T., et.al. 1985 Biochemistry, vol.24, p. 4374
26. Weinstein S., Wallace B.A., Boult E.R, et.al 1979 Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, vol. 76, p.4230
27. Weinstein S., Wallace B.A, et.al 1980 J. Mol.Biol., vol.143, p.1
28. Wallace B.A. 1986 Biophys. J., vol. 49, p.295
29. Kleinfeld A.M., 1987 Curr. Top. Membr. Tansp., vol.29, p.1
30. Scarlata S.F., 1988 Biophys.J., vol.54, p.1149
31. Veatch W.R, Mathies R., et.al. 1975 J.Mol.Biol., vol.99, p.75
32. Veatch W.R, Styer L. 1977 J.Mol.Biol, vol.113, p.89
33. Masotti L., Spisni A., et.al. 1980 Cell Biopys., vol.2, p.241
34. Bamberg E., Lauger P., 1977 J.Membr. Biol., vol.35, p.351
35. Killian J.A., de Kruijff B., et.al. 1983 Biochim. Biophys. Acta., vol.78, p. 141
36. Cornell B., Separovic F., et.al. 1988 Biophys.J., vol. 53, p. 67
37. Arseniev A. S Ovchinnikov Yu, A.., Barsukov, I. L.Bystrov, V. F,.Lomize, A. L. 1985 FEBS Lett., vol.186, p.168
38. Durkin J.T., Andersen O.S., et.al. 1986 Biophys.J., vol.49, p.118
39. Szabo G., Urry D. W. 1979 Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, vol.68., p.672
40. Bradley R.J., Urry D.W., et.al. 1978 Science, vol.200, p.435
41. Koeppe R.E. & Andersen O.S. 1996 Annu. Rev. Biophys.Biomol. Struct., vol. 25, p.231-258
42. Sychev, S. V.Barsukov, L. I.Ivanov, V. T. 1993 Eur Biophys J, vol.22, p. 279-88.The double pi pi 5.6 helix of gramicidin A predominates in unsaturated lipid membranes
43. Hladky S.B., Haydon D.A., 1972 Biochim. Biophys. Acta., vol.274, p.294
44. Eisenman G., Sandblom J.P., Neher E. 1978 Biophys.J., vol.22, p.307
45. Mazet J.-L., Andersen O.S.,Koeppe R.E. 1984 Biophys.J., vol.45, p. 263
46. Veatch W. R., Durkin J.T. 1980 J.Mol.Biol., vol.14, p.411
47. Hinton J.F., Whaley W.L., et.al. 1986 Biophys.J., vol.50, p. 539
48. Dani. J.A., Levitt D.G. 1981 Biophys.J., vol.35, p.501
49. Hinton J.F., Fernandez J.Q., et.al. 1989 Biophys.J., vol.55, p.327
50. Wallace B.A. 1983 Biopolymers, vol.22, p. 397
51. Hinton J.F., Koeppe R.E. II, et.al. 1986 Biophys.J., vol.49, p.571
52. Urry D.W., Trapane T.L., et.al. 1983 Science , vol.221, p.1064
53. Cornelis A., Laszlo P., 1989 Biochemistry, vol.18, p.2004
54. Arseniev A.S., Barsukov I.L., Bystrov V.F. 1985 FEBS Lett., vol.180, p.33
55. Koeppe R.E.II, Berg J.M., et.al. 1979 Nature, vol.279, p.723
56. Wallace B.A., Ravikumar K. 1988 Science, vol.241, p.182
57. Sung S. –S., Jordan P. C. 198 Biophys.J., vol.54, p. 519