Люминесцентный анализ методические рекомендации (стр. 3 из 4)
– источник возбуждающего света;
– селектор частоты возбуждающего света и частоты люминесценции;
– кюветное отделение, предназначенное для размещения кюветы с измеряемым образцом (стандартным образцом или пробой);
– фотоприемник люминесценции (фотоэлемент, фотоумножитель, фотодиод);
– усилитель сигнала;
– миллиамперметр.
Приборы, предназначенные для измерения флуоресценции, можно разделить на три категории: – флуориметры, флуоресцентные приставки к спектрофотометрам и спектрофлуориметры. Схема простейшего флуориметра приведена на рисунке 2.
Во флуориметрах селекция частот возбуждающего света и света флуоресценции осуществляется с помощью светофильтров. Флуориметры применяют для проведения серийных анализов, где снижение селективности не является большим недостатком, а высокая чувствительность, напротив, представляет собой важное достоинство.
 |
1 − источник УФ излучения; 2 − первичный светофильтр;
3 − кювета с образцом; 4 − вторичный светофильтр;
5 − фотоприемник; 6 - усилитель; 7 − миллиамперметр
Рисунок 2 - Схема простейшего флуориметра
При измерении флуоресценции с помощью флуориметров существенное значение имеет правильный выбор светофильтров, необходимых для разделения света, возбуждающего флуоресценцию (первичный светофильтр), и света флуоресценции (вторичный светофильтр). Первичный светофильтр должен пропускать свет в области поглощения определяемого вещества и не должен пропускать свет в области, отвечающей флуоресценции вещества. Вторичный светофильтр должен пропускать флуоресценцию, но возбуждающий свет должен им полностью поглощаться. Источниками возбуждающего света во флуориметрах обычно служат ртутные лампы низкого давления. С целью получения практически сплошного спектра излучения внутренние стенки этих ламп часто покрывают люминофором.
2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1 Определение содержания рибофлавина (витамина В2)
(6 часов)
Цель работы: освоение методов количественного люминесцентного анализа, приобретение навыков работы на флуориметре «Квант», определение витамина В2 методом прямой флуориметрии.
2.1.1 Краткая характеристика метода
Метод основан на сравнение интенсивности флуоресценции стандартного и анализируемого растворов витамина В1 при облучении светом ультрафиолетового диапазона. Содержание витамина В1 определяют, не прибегая к построению градуировочного графика лишь по одной точке, стандартный раствор при этом готовят с содержанием рибофлавина, близким к определяемому содержанию и не превышающим 1. 10-5 моль/дм3.
2.1.2 Необходимые реактивы
1. Рабочий стандартный раствор.
2. Анализируемый раствор.
Для приготовления рабочего стандартного раствора, содержащего 0,04 мг/см3 рибофлавина, взвешивают 0,0400 г рибофлавина в стаканчике или в фарфоровой чашке (навеску пересчитывают на чистую субстанцию). Затем навеску растворяют в горячей воде и переносят в мерную колбу объемом 1 дм3 на водяной бане. После охлаждения объем доводят до метки дистиллированной водой. Раствор годен в течение 1 месяца при условии его хранения в бутылке из темного стекла в холодильнике при температуре от 5 до 10 0С. В день проведения испытаний часть основного раствора переносят в стаканчик и выдерживают в темном месте до приобретения комнатной температуры, затем отбирают пипеткой 10 см3 раствора в мерную колбу объемом 100 см3 и доводят объем раствора до метки (1 см3 раствора содержит 0,0004 мг/см3 рибофлавина). Раствор годен только в день приготовления, а между измерениями хранится в темном месте.
В качестве анализируемого раствора используют или готовый раствор рибофлавина, или его готовят следующим образом: навеску растертых в ступке драже массой около 1 г взвешивают с точностью до 0,0002 г, растворяют в горячей дистиллированной воде при подогревании на водяной бане и количественно переносят в мерную колбу объемом 500 см3. Затем раствор охлаждают, доводят объем до метки и фильтруют через обычную фильтровальную бумагу (первые 10 см3 отбрасывают). Из полученного раствора готовят раствор второго разведения. Для этого отбирают 10 см3 раствора в мерную колбу на 100 см3 и доводят до метки дистиллированной водой. Расчетное содержание рибофлавина в растворе около 0,4 мкг/см3 или 0,0004 мг/см3. Между замерами раствор хранится в темном месте.
2.1.3 Выполнение работы на приборе «Квант»
Определение содержания рибофлавина проводят на приборе «Квант», внешний вид которого представлен на рисунке 3.
 |
1 - включение прибора в сеть; 2 - чувствительность; 3 - измерение;
4 - переключатель установка 100 % грубо; 5 - установка 0 %;
6 - установка 100 % точно; 7 - отсчетный лимб;
8 - шкала отсчетного лимба; 9 - первичный фильтр; 10 - вторичный
светофильтр; 11 - кюветное отделение; 12 - установка нуля;
13 - установка чувствительности; 14 - миллиамперметр
Рисунок 3 - Внешний вид флуориметра «Квант»
Для проведения измерений на флуориметре «Квант» необходимо соблюдать следующий порядок.
1. Включить прибор в сеть переменного тока с напряжением 220 В и нажать кнопку 1 «сеть», при этом загорается индикаторная лампочка.
2. Дать прибору прогреться не менее 60 мин.
3. По спектрам поглощения и флуоресценции (экспериментальные или литературные данные) выбрать необходимые первичный и вторичный светофильтры. При установке светофильтра необходимо следить, чтобы зеркальная поверхность первичного светофильтра была обращена к источнику света, а вторичного - к кювете.
При определении рибофлавина первый светофильтр синий (длина волны 440 нм), а второй светофильтр – зеленый (длина волны 520 нм).
4. Установить электрический нуль прибора, проделав следующие операции:
– перевести в левое положение ручку «0 %» до упора;
– вращением ручки «установка нуля» установить стрелку индикатора миллиамперметра на нуль.
5. Определить фон «холостого опыта» или растворителя и провести его компенсацию:
– установить в прибор кювету с растворителем («холостая проба»);
– нажать кнопку «Измерение» и вращением ручки отсчетного лимба установить стрелку индикатора на нуль (показания лимба будут соответствовать величине фона растворителя («холостого опыта»));
– установить на нуль шкалу отсчетного лимба «%», нажать кнопку «Измерение» и вращением ручки «установка 0 %» вывести стрелку индикатора на нуль. Фон растворителя будет скомпенсирован, и при дальнейших измерениях его можно не учитывать.
Внимание! При определении содержания рибофлавина «холостой пробой» является дистиллированная вода.
6. Заполнить кювету стандартным раствором. Нажать кнопку «Чувствительность» и вращением ручки «Установка чувствительности» добиться отклонения стрелки индикатора до деления 20 слева от 0. При этом надо следить, чтобы был выставлен 0 % на отсчетном лимбе и ручка «0 %» находилась в левом положении.
7. Не вынимая кювету с эталонным раствором, установить шкалу отсчетного лимба на деление 50 %. Нажать кнопку 1 переключателя «грубо», кнопку «Измерение» и вращением ручки «установка 100 % точно» установить стрелку индикатора на нуль. Если стрелка на нуль не устанавливается, включить кнопку 2 или 3 на переключателе «грубо», а затем нажать кнопку «Измерение» и ручкой «установка 100 % точно» добиться установки стрелки индикатора на нуль.
8. Определить интенсивность флуоресценции анализируемого раствора:
– установить в прибор кювету с анализируемым раствором;
– нажать на клавишу «Измерение» и вращением отсчетного лимба установить стрелку индикатора на нуль. Показания лимба будут соответствовать интенсивности светового потока флуоресценции исследуемого раствора в процентах.
2.1.4 Обработка результатов анализа
Содержание рибофлавина в одном драже (С) в граммах вычисляют по формуле
С =
, г (2. 1)где А - показания флуориметра при замере испытуемого раствора;
В – показания флуориметра при замере стандартного образца;
А1 и В1 - показания флуориметра после гашения флуоресценции гидросульфитом натрия в растворах ( из опытных данных равно 1).
V1 – объем испытуемого раствора, взятый для разведения (10 см3);
V2 – окончательный объем разведения (100 см3);
500 – первичный объем раствора, см3;
а – масса навески, взятая для испытания, г;
б – средняя масса одного драже, г;
1000 – коэффициент пересчета в граммы.
Содержание рибофлавина в готовом растворе (С, мг/см3) вычисляют по формуле
С =
, (2. 2)где Сст – содержание рибофлавина в стандартном растворе, мг/см3.
2.2 Флуориметрическое определение содержания
родамина 6Ж (6 часов)
Цель работы: определить содержание родамина 6Ж в исследуемом растворе с помощью метода калибровочного графика.
2.2.1 Краткая характеристика метода
Родаминовые красители (родамины) относятся к группе полярных ксантеновых красителей. Они обладают яркой флуоресценцией в жидких растворах (вода, спирт), что объясняется наличием у родаминов кислородных мостиков, придающих их молекулам необходимую «жесткость», а следовательно, и способность к флуоресценции. Родамины интенсивно поглощают в видимой и менее интенсивно в ультрафиолетовой части спектра. Поэтому для возбуждения их флуоресценции можно применять как видимый, так и ультрафиолетовый свет.