Исторически сложилось, что питательные среды на яичной основе (Левенштейна-Йенсена, Финна-2, Огавы, Аникина, ”Новая”, Попеску) получили наибольшее распространение среди плотных питательных сред, применяемых для выделения МБТ. Посев материала на среду Левенштайна-Йенсена проводят в бактериологической лаборатории. Рост первых колоний на классических средах отмечают через 4-8 недель. Однако появившиеся в последние годы агаровые среды Миддлбрука (7Н10, 7Н11) позволяют быстрее обнаружить рост микобактерий (от двух до четырех недель) и обеспечивают лучшие возможности для изучения морфологии колоний, чем на яичных средах. Недостатком агаризованных питательных сред является необходимость инкубации посевного материала в термостате с углекислым газом, поэтому агаризованные среды в России практически не применяются.
Следует отметить, что в связи с высокой избирательностью различных штаммов микобактерий и потребностью в полноценных белках до сих пор нет универсальной питательной среды, способной заменить все остальные. В Приказе № 109МЗ РФ для посева диагностического материала на МБТ рекомендуется использовать по одной пробирке международной питательной среды Левенштейна-Йенсена и Финна-2. Однако практика показывает, что кроме указанных сред целесообразно использовать и какую-либо из дополнительных, а посев на три пробирки питательной среды также повышает эффективность культуральной диагностики.
Для полноценной культуральной диагностики туберкулеза необходимо иметь соответствующие помещения и оборудование. Особенно важно наличие центрифуги и антиаэрозольной защитой и способностью обеспечить ускорение 3000g. А также шкафов биологической безопасности для предотвращения внутрилабораторного инфицирования.
Основным недостатком культуральной диагностики туберкулеза является длительность исследования – от трех недель до трех месяцев. Поэтому остаются актуальными дальнейшие исследования по разработке методов ускорения роста микобактерий.
Системы BACTEC
Культуральная диагностика туберкулеза переживает в настоящее время принципиальные изменения, связанные с внедрением в практику полностью автоматизированных систем культивирования МБТ. Главное отличие этих методов - применение жидких питательных сред для культивирования с последующей радиометрической (BACTEC 460), колорометрической
(Mb-Bact, Вас- tALERT) и люминесцентной детекцией роста (BACTEC MGIT 960). Рост МБТ на жидкой питательной среде в этих системах удается обнаружить уже через 1-2 недели в зависимости от их исходного количества в диагностическом материале. Частота выявления микобактерий так же несколько выше, чем на плотных питательных средах. Автоматизированные системы BACTEC с использованием соответствующих флаконов, содержащих различные противотуберкулезные препараты, позволяют сократить время исследования лекарственной устойчивости микобактерий до 10-14 суток.
Из перечисленных автоматизированных систем наиболее эффективна в настоящее время система BACTEC MGIT 960BD. Флаконы MGIT с жидкой питательной средой 7Н9 содержат в придонной части под силиконом флуоресцентный индикатор, “погашенный” высокими концентрациями кислорода. При наличии роста микобактерий в процессе поглощения кислорода индикатор начинает светиться, регистрация флуоресценции в сисиеме BACTEC MGIT производится автоматически. Использование флаконов MGIT возможно и “вручную”, тогда регистрацию свечения производят с помощью трансиллюминатора на флаконах MGIT составляет 11 суток.
Основным недостатком BACTEC MGIT, как и других систем BACTEC, является высокая стоимость оборудования (до 100000 долларов США) и флаконов с питательной средой – посев одной пробы диагностического материала стоит до 400 рублей .
Посев на L –формы микобактерий
Так называемые дефектные по клеточной стенке L-формы микобактерий и других инфекционных патогенов являются результатом изменчивости и основным видом персистирования, то есть переживания в неблагоприятных условиях. Посев на L-формы особенно эффективен при внелегочном туберкулезе, поскольку вегетация МБТ в очагах ВЛТ при повышенном ацидозе и анаэробиозе приводит к снижению их жизнеспособности и ферментативной активности.
Диагноз не может быть поставлен только на основании выявления L-форм микобактерий, но их обнаружение, особенно при верификации методом ПЦР, является весомым аргументом в пользу туберкулезной природы заболевания. В очагах внелегочного туберкулеза наблюдается ранняя L-трансформация микобактерий, поэтому их обнаружение позволяет поставить диагноз на начальных стадиях заболевания.
2.2 Молекулярно–генетические методы
К прямым методам обнаружения микобактерий туберкулеза можно отнести и бурно развивающиеся в последние годы подходы, сущность которых состоит в выявлении в исследуемых образцах диагностического материала специфических фрагментов цепи ДНК возбудителя. Среди применяемых для этого молекулярно-биологических методик наиболее широкое распространение получил метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), в основе которого лежит многократное увеличение числа копий специфического участка ДНК (так называемая направленная амплификация ДНК): 20 циклов ПЦР приводят к увеличению исходной ДНК в 1 миллион раз, что позволяет визуализировать результаты методом электрофореза в агарозном геле. Очень высокий уровень чувствительности (95 % и более), являющийся главным достоинством метода, достигается за счет того, что в результате многократного копирования уровень специфической олигонуклеотидной последовательности в редакционной пробе возрастает в 106 раз. По своей чувствительности метод ПЦР при туберкулезе органов дыхания в два раза превосходит эффективность культуральной диагностики.
Метод особенно актуален для туберкулеза, поскольку эффективен в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью, определение которых требует длительного культивирования или сложных питательных сред.
ПЦР-диагностика туберкулеза, как правило, строится на использовании последовательностей ДНК специфичных для всех 4 видов группы туберкулеза. Часто для этих целей используют праймеры для выявления последовательностей IS-элементов, например, IS-986 или IS-6110, поскольку данные мигрирующие элементы характерны только для видов микобактерий группы туберкулеза и присутствуют в геноме микобактерий в числе нескольких копий. Выделение ДНК из чистых культур и клинических образцов (мокроты больных) возможно осуществлять любым приемлемым методом, например, методом Boom с использованием лизирующего буфера на основе гуанидина, тиоционата и двуокиси кремния в качестве носителя ДНК.
Проведение ПЦР-диагностики туберкулеза
В качестве примера праймеров [49] для идентификации микобактерий группы туберкулеза можно привести праймеры, фланкирующие фрагмент размером 245 пар нуклеотидов мигрирующего элемента IS-986, содержащегося в геноме M.tuberculosis в числе 2-8 копий. Последовательно
Последовательность:
INS1 5' - CGT GAG GGC ATC GAG GTG GC - 3'
INS2 5' - GCG TAG GCG TCG GTG ACA AA - 3'
Амплифицированный фрагмент выявляют электрофорезом в 1,6 % агарозном геле.
Данная пара праймеров была проверена на специфичность с использованием в качестве контроля 100 нг/проба ДНК близкородственных микроорганизмов; ДНК возбудителей легочных заболеваний; ДНК микроорганизмов, входящих в микрофлору человека (например, E.coli,
S. aureus и др.); образцов ДНК человека.
Испытания данной пары праймеров с параллельным бактериоскопическим и культуральным обследоваванием были проведены на клинических образцах мокроты, полученных от больных с различными клиническими формами туберкулеза. Методом ПЦР возбудитель был выявлен у 90,6% больных туберкулезом, в то время как значительно более длительными по времени микробиологическими методами микобактерии были выявлены только у 39,6% больного.
Роль молекулярной диагностики в клинической практике повышается, поскольку увеличивается число больных со скудным бактериовыделением.
Однако применение метода ПЦР чревато получением большого количества ложноположительных результатов, обусловленных как техническими погрешностями, так и особенностями самого метода. Кроме того, метод не позволяет определять степень жизнеспособности выявляемых микобактерий.
Основным недостатком ПЦР является опасность лабораторной контаминации микобактериальной ДНК. Поэтому в настоящее время разработаны достаточно жесткие сертификационные требования для ПЦР-лабораторий, предусматриваюшие наличие трех изолированных помещений. ПЦР - это сложная современная технология, использование которой требует помимо соответствующей аппаратуры наличия высококвалифицированного персонала.
Таким образом, при постановке диагноза результаты ПЦР являются дополнительными и должны сопоставляться с данными клинического обследования, рентгенографии, микроскопии мазка, посева и даже ответа на специфическое лечение.
3 ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ
Среди других методов диагностики туберкулеза в некоторых регионах используют иммуноферментный анализ (ИФА), несущий информацию не о заболевании, а об инфицировании. ИФА выявляет антитела к микобактериям туберкулеза.
Это одно из наиболее интенсивно развивающихся направлений химической энзимологии. В твердофазном ИФА используется комбинация высокоспецифичной иммунологической реакции с чувствительным каталитическим действием ферментного маркера. Цель ИФА – выявление разнообразных веществ в крайне малых количествах (в концентрациях вплоть до 10-21 молей в образце), в том числе антигенов болезнетворных микроорганизмов и антител к ним.