3.1 Общие этапы в различных вариантах ИФА
В твердофазном ИФА один из специфических реагентов иммобилизуют на твердой фазе. Затем последовательно добавляют другие специфические реагенты, проводя после инкубации каждого из них промывку с целью удаления несвязавшихся компонентов. Один из специфических реагентов, так называемый конъюгат, содержит ферментную метку. Поэтому ферментативная активность образовавшегося на твердой фазе специфического комплекса будет пропорциональна концентрации каждого компонента этого комплекса, один из которых подлежит определению.
Разработанные варианты ИФА различаются типом твердой фазы и способами присоединения к ней первого специфического реагента, числом и последовательностью добавления остальных специфических реагентов, способом промывки твердой фазы, способом получения конъюгата, природой фермента в конъюгате, типом используемого субстрата, способом выражения результатов анализа и т. д. Тем не менее, в каждом варианте ИФА можно выделить следующие общие этапы:
- получение иммуносорбента;
- формирование многослойного комплекса на твердой фазе за счет последовательного проведения специфических реакций;
- удаление не специфически связавшихся компонентов, а также их избытка;
- получение ферментного конъюгата;
- измерение ферментативной активности специфического комплекса на твердой фазе;
- интерпретация результатов анализа.
Получение иммуносорбента
Присоединение первого специфического реагента к твердой фазе может осуществляться путем физической сорбции, ковалентного связывания или комбинированного использования этих подходов.
Методы физической сорбции. Физическая сорбция специфического реагента на твердой фазе происходит за счет гидрофобных, донорно-акцепторных взаимодействий или водородных связей. Основные недостатки методов физической сорбции: десорбция на последующих стадиях анализа и малая величина сорбционной емкости.
Методы ковалентного связывания. В такие полимеры, как полистирол вводят новые реакционные группы типа амино-, гидразидо- или диазогрупп. Твердые фазы из нейлона или капрона подвергают частичному кислотному гидролизу, приводящему к образованию амидных групп. Суспензионные твердые фазы уже содержат реакционноспособные гидроксильные, амидные или карбоксильные группы. Ковалентное присоединение к ним специфического реагента, содержащего аминогруппы, может быть осуществлено с помощью таких реагентов, как глутаровый альдегид, бромциан, гидразин, 1,4-диэпоксипентан, дивинилсульфон, эпихлоргидрин, гидрохинон, периодат натрия, водорастворимые карбодиимиды и др. Основными преимуществами ковалентного связывания следует считать более высокую воспроизводимость результатов и возможность многократного использования иммобилизованной твердой фазы.
Методы комбинированной сорбции. При всей привлекательности методов химической сорбции они не получили широкого распространении из-за трудоемкости проведения. Поэтому в тех случаях, когда специфический реагент плохо сорбируется на твердой фазе, используют комбинацию физической сорбции вещества с высокой сорбционной способностью и простейших способов ковалентного присоединения к нему нужного специфического реагента.
Получение специфического комплекса на твердой фазе
После получения иммуносорбента к нему последовательно добавляют другие специфические реагенты, в результате чего на твердой фазе формируется многослойный комплекс. Природа специфических реагентов может быть разной. Определяющими моментами на этих стадиях ИФА являются специфичность реакции, характеризующаяся величиной константы связывания, и кинетика процессов.
В ИФА основной специфической реакцией является взаимодействие антигена с антителом.
Антитела, или иммуноглобулины представляют собой белки, реагирующие с антигеном, который индуцировал их образование. Они состоят из 2 пар цепей, соединенных между собой дисульфидными связями. Внутри каждой пары (легкая L и тяжелая Н) цепи между собой идентичны. В зависимости от типа Н-цепей иммуноглобулины подразделяют на 5 классов. Легкие цепи делят на 2 типа, обозначаемые χ (капа) и λ (лямбда). Оба типа L-цепей входят в состав всех 5 классов иммуноглобулинов. Такие классы как ИгГ(IgG), ИгД(IgD), ИгЕ(IgE) находятся в виде мономеров, ИгМ(IgM) встречается преимущественно в виде пентамера, а ИгА (IgA) - в виде моно-, ди- и тетрамеров. По результатам протеолиза такими ферментами, как папаин и пепсин, в иммуноглобулинах выделяют Fab- и Fc-фрагменты. Специфической активностью по отношению к антигену обладают Fab-фрагменты, Fc-участок отвечает за основные эффекторные функции антител.
Антигенами называются вещества или структуры, способные вызывать иммунный ответ. Как правило, антигены имеют многочисленные детерминанты (эпитопы); к которым специфичны активные центры Fab-фрагментов образующихся антител. Набор детерминант определяет специфичность антигена, а их число его валентность. Для антигенной специфичности белков имеет значение их конформация. Изменение конформации при денатурации белка приводит к потере некоторых детерминант. В основе взаимодействия перекрестно реагирующих антител с антигенами лежит структурное сходство с детерминантами специфического антигена.
Прочность связи Fab-фрагмента с антигенной детерминантой называется аффиностью и определяется величиной константы равновесия данной реакции. Для поликлональной сыворотки эта величина будет различной для тех молекул антител, которые являются продуктами разных В-клеток. В случае моноклональных антител такие различия исчезают. Так как антитела многовалентны (от 2 для ИгГ до 10 для ИгМ), то для характеристики прочности связывания антител с соответствующим антигеном вводят термин авидность. Она зависит от аффинности Fab-фрагментов и валентности антител.
Наряду с реакцией антиген–антитело, широкое распространение в ИФА получил белок А из-за своей способности специфически взаимодействовать с Fab-фрагментами многих иммуноглобулинов.
В последние годы широкое распространение в ИФА получила реакция между биотином и авидином (стрептавидином), позволяющая осуществлять связь между различными компонентами специфического комплекса на твердой фазе.
В ИФА используется также специфическая реакция между лектинами и углеводными остатками различных гликопротеинов.
Устранение неспецифических взаимодействий на этапе промывки
После каждого этапа инкубации специфического реагента с твердой фазой следует этап промывки. Ее цель заключается в получении моно-молекулярного слоя первого специфического реагента и устранении взаимодействий реагент — твердая фаза после инкубации последующих реагентов, а кроме того, в уменьшении количества перекрестно реагирующих антигенов со специфическим реагентом.
В результате сорбции первого специфического реагента происходит образование вначале мономолекулярного слоя на твердой фазе, а затем многослойной сорбции за счет белок-белковых взаимодействий. Добавление в промывной раствор неионных детергентов типа твин-20 позволяет осуществлять эффективную конкуренцию между белок-белковыми взаимодействиями за счет взаимодействия белок-детергент. Это же взаимодействие уменьшает сорбцию белка на твердой поверхности после частичного разрушения мономолекулярного слоя. Так как все эти процессы равновесные, то для более полного устранения многослойной сорбции необходима многократная промывка твердой фазы.
3.2 Компоненты ИФА
Антигены, используемые в ИФА
В ИФА в качестве иммуносорбента используются, как уже говорилось выше, антигены. Одним из важных моментов при создании диагностического теста является определение его антигенной композиции. При этом, в зависимости от цели диагностики состав антигенов может быть различным.
Известно, что для полноценной и эффективной детекции антител при диагностике инфекционного заболевания, необходимо максимально имитировать антигенный состав нативного возбудителя.
Использование смеси, состоящей из нескольких белковых молекул, для сорбции иммунологических планшетов может приводить к определенным проблемам как биотехнологического, так и экономического характера (усложнение и, следовательно, удорожание процесса производства). Белки могут конкурировать за сорбционную поверхность, а также может происходить взаимодействие белков в реакционной смеси, что может приводить к экранированию части эпитопов. Кроме того, белковые молекулы могут требовать различных условий сорбции, обеспечивающих каждому антигену наиболее полную экспрессию всех эпитопов. Современные методы позволяют конструировать искусственные рекомбинантные молекулы, объединяющие различные антигенные эпитопы, локализованные в разных белках инфекционного агента и даже принадлежащие его разным штаммам. Компьютерный анализ позволяют оценивать пространственную структуру нативных вирусных белков и точно воспроизводить ее при дизайне искусственных молекул антигенов.
Применяемые в ИФА антигены делятся на две группы:
- синтетические
- рекомбинантные
Получение рекомбинантных белков
Технология рекомбинантных ДНК (генная инженерия) – это совокупность экспериментальных процедур, позволяющая осуществлять перенос генетического материала (ДНК) из одного организма в другой . Чаще всего эксперименты проводят по следующей схеме.
Из организма–донора нужных генов – экстрагируют нативную ДНК либо синтезируют химически. Соединяют ее с другой ДНК – вектор для клонирования – с образованием новой рекомбинантной молекулы. Эту конструкцию вводят в клетку-хозяина, где она реплицируется и передается потомкам. Этот процесс называется трансформацией. Идентифицируют и отбирают клетки, несущие рекомбинантную ДНК. Получают специфический белковый продукт, синтезированный клетками-хозяевами, что служит подтверждением клонирования искомого гена.