Моноклональные антитела получают, выращивая гибридомы на культуральной среде, или из асцитной жидкости. Гибридомы, выращиваемые в сосудах для культивирования, синтезируют 5-10 мкг антител на 1 мл среды. При использовании специальных микроносителей типа "Биосилон", выпускаемых фирмой "Нунк", количество антител увеличивается до 100 мкг/мл.
Важнейшим свойством гибридом, унаследованным от миеломных клеток, представляется их способность давать асцитные опухоли при введении мышам и синтезировать при этом до 15мг антител из 1 мл асцитной жидкости.
Химическая модификация молекулы антитела при получении конъюгатов в некоторых случаях может приводить к уменьшению констант связывания в 10 раз и более. Это послужило стимулом для получения гибридных моноклональных антител, содержащих два различных антиген связывающих центра, один из которых направлен к определенному антигену, а другой – к ферменту, используемому в качестве метки.
Первой стадией при создании гибридных моноклональных антител является получение обычной гибридомы, синтезирующей моноклональные антитела желаемой специфичности к одному из двух антигенов. Затем гибридому адаптируют к росту в присутствии 8-азогуанина и отбирают те клетки, которые способны размножаться на ГАТ-среде. Эти первичные гибридомы, выступающие в роли миеломного партнера, подвергают слиянию с иммунными лимфоцитами мышей, иммунизированных вторым антигеном. В результате слияния и отбора получают дочерние (вторичные) гибридомы, способные синтезировать антитела двойной специфичности. Таким способом были получены гибридные моноклональные антитела, которые одновременно связывались с пероксидазой хрена и поверхностным антигеном. Гибридные антитела оказались стабильными в процессе хранения, не изменяли своей двойственной специфичности и обладали достаточно высокими константами связывания по отношению к обоим антигенам.
3.3 Специфичность и чувствительность ИФА
Под чувствительностью понимается та минимальная концентрация определяемого реагента, при которой заметно различие в величине сигнала этой концентрации и образца, заведомо не содержащего определяемого реагента (отрицательный контроль). Эта разница в величине сигналов должна составлять 2 - 3 величины стандартного отклонения (СО) для отрицательного контроля.
Для качественной диагностики, когда важно наличие или отсутствие антител в исследуемой пробе используют положительно-отрицательный метод. Положительным значением (+) считают величину сигнала, которая в 2 - 3 раза превышает сигнал от контрольного образца, не содержащего определяемые антитела (-). Процент положительных проб представляет собой выявляемость метода.
Также на чувствительность влияет ферментативная активность коньюгата. Наряду с ферментативной активностью конъюгата большое влияние на чувствительность анализа оказывает тип используемого субстрата. Продукт ферментативного превращения субстрата должен обладать новым физико-химическим параметром, позволяющим детектировать его с высокой чувствительностью. Такими параметрами являются: поглощение света в видимой области (хромофорные субстраты), флуоресценция в видимой области (флуоресцентные субстраты) и хемилюминисценция (хемилюминисцентные субстраты).
Высокая чувствительность ИФА достигается также благодаря использованию различных физических методов регистрации ферментативной активности: фотометрических, флуориметрических, био- и хемилюминесцентных. Как всякий аналитический метод, ИФА имеет свои ограничения, связанные с биологической природой молекул детектора (антитела) и усилителя (фермента). Применение ИФА в диагностических целях требует изучения причин неспецифических реакций и их устранения. Как высокочувствительный метод ИФА чрезвычайно зависит от качества реагентов и техники проведения исследования.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Иммуноферментный анализ по сравнению с другими методами детекции антигенов обладает следующими преимуществами.
- высокой чувствительностью, позволяющей выявлять концентрации до 0,05 нг/мл. Такая чувствительность метода определяется способностью одной молекулы фермента катализировать превращение большого числа молекул субстрата;
- возможностью использовать минимальные объемы исследуемого материала;
-стабильностью при хранении всех ингредиентов, необходимых для проведения ИФА (до года и более);
- простотой поведения реакции
Разработка методов, позволяющих сократить сроки обнаружения микобактерий туберкулеза является очень актуальной задачей в связи с сложившейся эпидемиологиечской ситуацией в нашей стране.
На данный момент в ОНТ НИИ им. Пастера разработана и выпускается иммуноферментная тест-система для обнаружения антител к возбудителю туберкулеза(ИФА-анти-ТУБ).
Данная иммуноферментная тест-система для обнаружения антител к возбудителю туберкулеза дала существенно новые возможности улучшения диагностики туберкулеза, что позволило ввести данный метод в комплекс мер по осуществлению противотуберкулезной работы в нашей стране.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
1 . Биотехнология: Учеб. Пособие для вузов. В 8 кн./под ред. Н.С.Егорова, В.Д. Самуилова. Кн.8: Инженерная энзимология/ И.В. Березин, А.А. Клесов, В.К.Швядас и др.-М.: Высш.Шк., 1987.-143 с.
2. Бурков А.Н. Методология конструирования коммерческих тест – систем для диагностики инфекционных заболеваний: Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук.
//www. npods.ru/upload/1046603660.doc
3. Вербов В.Н. Принципы твердофазного иммуноферментного анализа. //Твердофазный иммуноферментный анализ. Труды института имени Пастера, т. 64. 1988. С 3-27.
4. Вершигова А.Е.Общая иммунология: Учеб. пособие. К.: Высшая школа, 1989. – 736 с.
5. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология, М.: Мир, 2002.
6. Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа – М.: Высшая школа, 1991.-288 с
7. Иммунобиотехнология. Заикина Н.А., Галынкин В.А., Гарабаджиу А.В. -Спб.: Изд-во “Менделеев”, 2005-155 с.
8. Иммуноферментный анализ: Пер. с англ./Под редакцией Т.Нго, Г.Ленхоффа.-М.: Мир, 1988.-446 с.
9. Рыбчин В.Н. Основы ген. Инженерии.2-е изд., перераб. и доп.: Учебник для вузов. Спб.: Изд-во СПбГТУ, 1999- 522 с.
10. Сингер М., Берг П.Гены и геномы,-М.: Мир,1998
11.Черноусова Л.Н., Русский медицинский журнал том 10,№ 16 “Социально – значимые заболевания”, 2002 г.
12. Шебанов Ф.В. Туберкулез.-М.: Медицина, 1981-386 с.