Научно-методический центр пищевых инфекций методы частной бактериологии (стр. 18 из 55)
Лабораторная диагностика
Помимо общих лабораторных исследований, включает выделение возбудителя по стандартной схеме. На наличие возбудителей указывает появление a-гемолизирующих или негемолизирующих колоний, S. anginosus образует мелкие (>0,5 мм) колонии, окруженные зоной a- или b-гемолиза. Дальнейшую дифференцировку проводят по отсутствию способности расти на жидких средах с 6,5% NaCI (в отличие от энтерококков), неспособности гидролизовать эскулин в присутствии солей желчных кислот (могут быть положительны 10% изолятов), отсутствию чувствительности к оптохину. Следует с осторожностью применять коммерческие наборы для видовой идентификации, т.к таксономия зеленящих стрептококков нуждается в доработке и постоянно совершенствуется. S. bovis можно идентифицировать с помощью антисыворотки к Аг стрептококков группы D
Стрептококки групп С и G являются членами микробных сообществ верхних отделов дыхательных путей и ЖКТ многих млекопитающих, и спорадически колонизируют кожные покровы, зев, мочеполовую систему и кишечник. Систематика микроорганизмов нуждается в более детальной проработке. У человека наиболее часто выделяют S. equisimilis, S. dysgalactiae, S. zooepidermicus, S. equi и недифференцированные виды, образующие крупные колонии; к этой группе также относятся некоторые изоляты S. anginosus, не проявляющие микроаэрофильных или анаэробных свойств. Эти виды в большей степени патогенны для животных, но и у человека вызывают разнообразные поражения, хотя их регистрируют сравнительно редко. Поражения развиваются как при употреблении различных загрязненных животных продуктов, так и эндогенно, из имеющихся очагов. Патогенез поражений аналогичен прочим стрептококковым инфекциям; основные факторы патогенности — гиалуронидаза, фибринолизины, стрептокиназа, стрептолизин О и эритрогенные токсины. Дефектные (прихотливые) виды (S. defectivus, S. adjacens), требующие для роста внесения в среду пиридоксина (витамина В6), вызывают редкие случаи эндокардитов, и их выделяют из гемокультур. Дифференцировку проводят на основании результатов реакций латекс-агглютинации и изучения биохимических особенностей.
Род Enterococcus образуют овальные бактерии размером 0,6-2,0´0,6-2,5 мкм, в мазках культур, выращенных на жидких средах, располагаются парами или короткими цепочками. Спор не образуют, некоторые виды ограниченно подвижны (имеют небольшие жгутики), капсул не имеют. Факультативные анаэробы; хемоорганотрофы (метаболизм ферментативный); расщепляют различные углеводы с образованием кислоты (преимущественно молочной) без газа. Пищевые потребности сложные, каталазоотрицательны, в редких случаях восстанавливают нитраты. Растут в интервале 10-45°С (оптимум 37°С). Типовой вид — E.faecalis. Широко распространены в природе, обитают в кишечнике различных позвоночных, вызывают нагноения ран, бактериемии и поражения мочевыводящей системы. Ранее микроорганизмы систематизировали как стрептококки группы D (некоторые также реагируют с антисыворотками к группе Q). У человека наиболее часто поражения вызывают E.faecalis, E.faecium и Е. durans; их отличительные признаки приведены в таблице 10.
Таблица 10. Основные отличительные признаки энтерококков, патогенных для человека
| Признак | Е. durans | Е. faecalis | Е. faecium |
| Подвижность | – | ± | ± |
| Рост при 45°С | + | + | + |
| Рост при 50°С | – | ± | + |
| Рост на средах, содержащих: | |||
| 6,5% NaCI | + | + | + |
| 0,04% теллурита | – | + | – |
| молоко с 0,1% метиленовым синим | + | + | ? |
| Образование желтого пигмента | – | – | – |
| Гемолиз | a, b | Иногда a | Иногда b |
| Гидролиз гиппурата | ± | ± | + |
| Образование кислоты из: | |||
| Рамнозы | – | ± | – |
| Сахарозы | – | + | ± |
| Арабинозы | – | – | + |
| Глицерина | – | + | + |
| Сорбита | – | + | – |
| Маннита | ± | + | + |
| Серологическая группа по Лэнсфилд | D | D | D |
Распространение
Энтерококки входят в состав микрофлоры ротовой полости, кишечника и мочеполовой системы; так, E. faecium выделяют из испражнений у 25% клинически здоровых лиц. Большинство инфекций, вызванных энтерококками, носит эндогенный характер и обусловлено инвазией микроорганизмов при избыточной колонизации; также показана возможность нозокомиальной передачи микроорганизмов, частота подобных инфекций возрастает на фоне высокой частоты применения цефалоспоринов широкого спектра действия.
Клинические проявления
Энтерококки часто вызывают поражения мочеполовой системы. Также они вызывают 10-20% всех бактериальных эндокардитов и 5% бактериемий. Эндокардиты характеризуются вялым подострым течением с постепенным развитием клапанной недостаточности. Бактериемии могут развиваться как следствие поражений мочевой системы или внутрибрюшинных абсцессов; в 40% случаев источник проникновения бактерий в кровоток остается неизвестным. Гемолизирующие энтерококки также способны вызывать пищевые отравления и дисбактериозы кишечника.
Лабораторная диагностика
Выделение возбудителя обычно не представляет трудностей (рис. 8), т.к. энтерококки хорошо растут на простых средах; на кровяном агаре могут давать зоны полного (редко) или неполного гемолиза. Через 24 ч энтерококки образуют сероватые колонии диаметром 0,4-1 мм; признаками, дифференцирующими их от зеленящих стрептококков, являются: способность расти на средах, содержащих 6,5% NaCI, а также способность изменять окраску лакмусового молока или молока с этиленовым синим через 4-6 ч при 37°С.
Рисунок 8. Принципиальная схема бактериологического выделения энтерококков
Питательные среды для культивирования стрептококков
Глюкозо-сывороточный бульон. К свежему стерильному МПБ (рН 7,4-7,6) добавляют 10% нормальной инактивированной сыворотки крови лошади и 1% глюкозы. Сыворотку и глюкозу предпочтительнее стерилизовать фильтрацией.
Глюкозо-кровяной агар. К расплавленному МПА с температурой около 45°С добавляют 1% глюкозы и 5—10% стерильной дефибринированной крови барана или кролика. Приготовленный агар разливают в чашки Петри.
Среда Эдварда (пропись фирмы Oxoid, 1982). В 1 л дистиллированной воды растворяют 10 г пептона, 10 г сухого мясного экстракта, 1 г эскулина, 5 г натрия хлорида, 0,0013 г кристаллвиолета, 0,33 г таллия сульфата и 15 г агара; устанавливают рН 7,4, Стерилизуют при 115° С 20 минут. К охлажденному до 45° С агару добавляют 5% стерильной дефибринированной крови овцы или крупного рогатого скота и разливают в чашки Петри. Среда обладает селективными свойствами. Используют для выделения S. agalactiae.
Кровяной агар с азидом натрия (пропись фирмы Oxoid, 1982). В 1 л дистиллированной воды растворяют 10 г триптозы, 3 г сухого мясного экстракта, 5 г натрия хлорида, 0,2 г азида натрия, 12 г агара; устанавливают рН 7,2, автоклавируют при 121°С 15 минут. К расплавленному агару с температурой 45°С добавляют 5% стерильной крови овцы, перемешивают и разливают в чашки Петри. Среда предназначена для выделения патогенных стрептококков из материалов, контаминированных посторонней микрофлорой. Азид натрия подавляет рост многих грамотрицательных бактерий.
Селективная среда с антибиотиками (пропись фирмы Oxoid, 1982). В расплавленную и охлажденную агаровую среду добавляют 7% дефибринированной крови барана и антибиотики (на 1000 мл среды): налидиксовой кислоты - 7,5 мг, полимиксина В - 17000 ЕД, неомицина (или неомицина сульфата) - 2,12 мг. Каждый антибиотик предварительно растворяют в 20 мл стерильной дистиллированной воды, Готовую среду используют в течение 48 ч при хранении в холодильнике (4-8°С). На среде ингибируется рост стафилококков, синегнойной палочки, энтеробактерий, клебсиелл и предотвращается роение протея. Если после засева на поверхность среды положить полоски фильтровальной бумаги (диски), пропитанные бацитрацином (10 ЕД), то можно дифференцировать стрептококки серогруппы А (чувствительные к бацитрацину) от (3-гемолитических стрептококков других групп, устойчивых к бацитрацину (Streatmer et al., 1962).
Молочная среда с полимиксином по Калине (для энтерококков). К 85 мл расплавленного МПА с температурой 45°С добавляют 1,25 мл 0,01%-ного водного раствора кристаллвиолета, 0,5 мл 10%-ного водного раствора 2,3,5-ТТХ, 15 мл стерильного обезжиренного молока, 20-40 ЕД/мл полимиксина М. Среда, разлитая в чашки Петри, пригодна для использования в течение 7—10 дней при условии хранения в холодильнике (4°С). Типичные колонии энтерококков имеют округлую форму, ровные края, блестящую поверхность, диаметр 1,5-2 мм, красноватую окраску с зоной протеолиза на светло-голубом фоне.