Данная синтетическая среда рекомендуется для культивирования актиномицетов (Waksman, 1931).
Мальтозный (глюкозный) агар Сабуро (Кашнин, 1973). В 1000 мл дистиллированной воды растворяют мальтозы (или глюкозы) — 4 г, пептона — 1 г, агар-агара — 1,8 г. Среду фильтруют, разливают по колбам, пробиркам и стерилизуют при 110°С 15 минут.
Для культивирования актиномицетов можно применять кровяной агар, среду Леффлера, тиогликолевые среды и среды, предназначенные для культивирования анаэробов, не содержащие специальных селективных добавок, например агар и бульон Шадлера (см. Питательные среды для культивирования клостридий).
Во всех случаях надо учитывать, что A. pyogenes лучше растет на средах с кровью (сывороткой крови) и утилизируемыми углеводами, A. hordeovutaeris — с 15-20% фетальной сывороткой. Для изоляции ряда актиномицетов применяют питательные среды с селективными добавками.
Среда Бейгтона и Колмана (1976). Состав питательной среды: сердечно-мозговой бульон — 3,7 г, дрожжевой экстракт (порошок) — 0,5 г, поливинилпироллидон — 1,0 г, цистеин солянокислый — 0,1 г, агар — 1,5 г, вода дистиллированная — 100 мл. Компоненты растворяют, стерилизуют при 115°С 30 минут, охлаждают до 45°С и вносят 5 мл стерильной сыворотки крови кролика. Затем к 100 мл готовой питательной среды добавляют 1 мл раствора NaF (25 мг/мл), 0,5 мл стерильного раствора колистина сульфата (1 мг/мл). Эти растворы предварительно стерилизуют. Среду используют для культивирования оральных актиномицетов.
Среда Корнмана и Лоше (1978). В качестве основы используют обогащенную плотную среду. К основной среде добавляют метронидазол—10 мкг/мл и кадмия сульфат—20 мг/мл. Кадмия сульфат стерилизуют автоклавированием вместе с основной средой, метронидазол фильтруют и вносят в среду на последнем этапе. Среда рекомендована для культивирования A. viscosus и A. naeslundii.
Fritsche (1964) выделил культуру A. israelii из контаминированного материала на неселективных средах благодаря предварительной специальной обработке материала.
Материал предварительно суспендируют в транспортной среде. Например, среде Syed, Loesche (1972) следующего состава: раствор 1 — 0,6% раствор К2НРO4, раствор 2 — 1,2% NaCI, 1,2% (NH4)2SO4, 0,6% КН2РO4, 0,25% MgSO4. Готовая среда содержит 75 мл раствора 1,75 мл раствора 2, а также 10 мл 1М раствора этилендиаминтетраацетата, 20 мл свежего 1%-ного раствора дитиотреитола, 5 мл 8%-ного раствора Na2CO3, 1 мл 1 %-ного раствора резазурина, 814 мл дистиллированной воды. Среду стерилизуют фильтрацией (рН 8,0).Исследуемый материал суспендируют в транспортной среде. 1 мл исследуемой суспензии смешивают с 1 мл толуола и встряхивают 20 минут. Водную фазу отсасывают пипеткой, добавляют к ней 10 мл транспортной среды, центрифугируют и осадок засевают на неселективную питательную среду. Эффект обработки основан на ингибирующем действии толуола на грамотрицательные бактерии.
Микроорганизмы рода Pseudomonas
Представители рода Pseudomonas — прямые или слегка изогнутые палочки; средние размеры 0,5-1,0´1,5-5,0 мкм. Аэробы, метаболизм строго дыхательного типа (терминальный акцептор электронов — О2), но некоторые виды используют нитраты в качестве альтернативных акцепторов электронов, что дает им возможность расти в анаэробных условиях. Многие виды аккумулируют поли-b-гидроксибутират в качестве резервного источника углерода (в мазках выявляется в форме суданофильных включений). Хемоорганотрофы, некоторые виды — факультативные хемолитотрофы и используют Н2 и СО в качестве источников энергии. Подвижны (один или несколько жгутиков расположены полярно), кроме бактерий вида Pseudomonas mallei; спор не образуют. Большинство (если не все) видов не растут в кислой среде. Большинство окисляет глюкозу и другие углеводы (несахаролитические виды не способны к их окислению), а также каталазоположительны. Многие виды свободноживущие, либо считаются растительными и животными патогенами. Типовой вид — Pseudomonas aeruginosa. На основании гомологии РНК/ДНК изучаемые виды (их 27) Pseudomonas разделены на 5 гомологичных групп по структуре рибосомальной РНК и на несколько групп, имеющих гомологичную ДНК; соответственно предложено выделить из рода Pseudomonas некоторые микроорганизмы в роды Burkholderia, Stenolrоphomonas и др. Вполне очевидно, что идентификация возбудителя инфекции до уровня вида может принципиально изменить характер эмпирической терапии, что обусловлено, в первую очередь, различиями в их природной чувствительности (устойчивости) к антибиотикам. Практическая необходимость видовой идентификации отдельных представителей семейства Pseudomonadaceae также обусловлена задачами эпидемиологической, эпизоотической диагностики.
Pseudomonas aeruginosa (синегнойная палочка)
Один из основных возбудителей инфекционных поражений человека и животных, вызываемых псевдомонадами. Микроорганизм выделяют из кишечника 5% здоровых лиц и до 30% госпитализированных пациентов. Первое описание раневой инфекции, вызванной синегнойной палочкой, принадлежит Люке (1862), отметившему характерное сине-зеленое окрашивание перевязочного материала; в чистой культуре микроорганизм выделил Жессар (1882), изучивший его основные культуральные свойства. Первая вспышка госпитальной инфекции, вызванной Pseudomonas aeruginosa, зарегистрирована в 1897 г (Багински), но уже в 1899 г С.Н. Серковский указывал, что патогенные свойства микроорганизма чаще реализуются в организме лиц с ослабленным иммунитетом (детей и истощенных больных). Начиная с 70-х гг. Pseudomonas aeruginosa — один из основных возбудителей локальных и системных гнойно-воспалительных процессов, особенно в условиях стационаров. Более того, была показана патогенность синегнойной палочки для рыб, различных млекопитающих и даже растений.
Pseudomonas aeruginosa распространена повсеместно, ее выделяют из почвы, воды, с растений и от животных (водных или обитающих в ареалах с повышенной влажностью). Вода имеет существенное значение в циркуляции возбудителя, в ней он может выживать до года (при 37°С), в том числе во многих растворах, применяемых в практической медицине и ветеринарии, вплоть до жидкости для хранения контактных линз. Иногда входит в состав нормальной микрофлоры человека; у здоровых индивидуумов Pseudomonas aeruginosa выявляют на коже паха, подмышечных областей и ушей (до 2% лиц), на слизистой оболочке носа (до 3% лиц) и глотки (до 7%), в ЖКТ (3-24%). Поскольку возбудитель особенно обильно обсеменяет медицинское оборудование и циркулирует среди персонала и пациентов, то госпитализация существенно увеличивает колонизацию организма. Риск развития инфекции, вызванной синегнойной палочкой, существенно возрастает у больных с нарушениями барьерных систем и факторов резистентности. Инфицирование Pseudomonas aeruginosa вызывает до 15-20% всех внутрибольничных инфекций, считается одним из основных возбудителей нозокомиальных пневмоний (до 20%), вызывает треть всех поражений мочеполовой системы у урологических больных и считается причиной 20-25% гнойных хирургических инфекций и первичных грамотрицательных бактериемий. В большинстве случаев источник инфекции и путь передачи обнаружить не удается, т к. резервуарами возбудителя могут быть самые различные объекты (например, сырые овощи или букет цветов).
Часто синегнойную инфекцию наблюдают у больных с ожогами, заболеваниями мочевого пузыря, особенно у пациентов, длительно получающих антибиотики, что обусловлено выраженной устойчивостью возбудителя.
Одним из важных факторов инфицирования пациентов считается нарушение правил стерилизации, хранения и применения мочевых и сосудистых катетеров, игл для поясничных пункций, оборудования для обеспечения дыхания больного, а также различных растворов.
Высокий риск развития наблюдают как у лиц с иммунодефицитами (вызванными основной патологией), так и у лиц, длительно получающих цитостатики, глюкокортикоиды и антибиотики.
Средние размеры - 1-3´0,5-1 мкм; в нативных препаратах подвижны (имеют один или два полярных жгутика). В мазках чистых культур расположены одиночно, парно, либо в виде коротких цепочек; в мазках из патологического материала их чаще можно обнаружить в цитоплазме фагоцитов, при этом палочки могут быть деформированы; в клиническом материале полиморфизм отсутствует, а каких-либо включений не наблюдают. Синтезирует крахмалоподобное вещество, покрывающее тонким слоем микробную клетку, но не формирующее морфологически очерченного слоя. Более вирулентные штаммы синтезируют повышенное его количество (мукоидные штаммы), что дает основание рассматривать слизь как фактор патогенности. Наиболее часто мукоидные штаммы выделяют из мокроты больных при заболеваниях легких (например, при бронхоэктатической болезни). Формируя капсульное вещество в пораженном организме, клинические изоляты могут легко терять это свойство в первых лабораторных генерациях. Обычно фиксированные препараты окрашиваются по Граму отрицательно.
Растет в широком диапазоне температур (4-42°С), что указывает на способность длительно сохраняться в окружающей среде и противостоять защитному повышению температуры тела. Отличительная особенность — ограниченная потребность в питательных веществах, обеспечивающая сохранение жизнеспособности в условиях почти полного отсутствия источников питания. При полном отсутствии углерода количество палочек и их ферментативная активность за неделю снижаются в 10-100 раз, при внесении минимальных количеств углеродсодержащих питательных веществ число палочек восстанавливается в короткие сроки. Pseudomonas aeruginosa хорошо растет на простых питательных средах в аэробных условиях при температуре 30-37°С, а также и при 42°С (что можно использовать как дифференциально-диагностический признак). Образование слизи — характерная особенность; слизь придает характерную вязкость бульонным культурам и колониям мукоидных штаммов.