На жидких средах (например, пептонной воде, МПЖ, бульоне Хоттингера) образует характерную серовато-серебристую пленку; по мере старения культур возникает помутнение среды сверху вниз.
На плотных средах (например, МПА, КА, среде Эндо, Левина, Плоскирева, ЦПХ-агаре) образует весьма разнообразные колонии; на средах Эндо и Плоскирева обычно выделяют колонии следующих типов:
– плоские, неправильной формы, иногда склонные к слиянию, с волнистыми краями;
– напоминающие S-колонии Escherichia соli;
– складчатые с неровной поверхностью («маргаритки»);
– слизистые или мукоидные колонии;
– карликовые или точечные, формирующиеся к 18-24 ч роста при 37°С.
При росте на плотных средах у многих штаммов наблюдают феномен радужного лизиса, развивающийся спонтанно. Феномен характерен только для Pseudomonas aeruginosa, его можно рассматривать как таксономический признак. Более того, он индивидуально выражен у отдельных штаммов, и его можно использовать для внутривидовой дифференциальной диагностики. При образовании пигмент окрашивает некоторые среды, например агар Мюллера—Хинтона или МакКонки, в зеленый цвет.
Pseudomonas aeruginosa — выраженный хемоорганотроф; метаболизм дыхательный, никогда не бродильный; строгий аэроб. В качестве источника энергии синегнойная палочка использует Н2 или СО. Универсальный акцептор электронов — молекулярный кислород. Как и большинство патогенных гноеродных микроорганизмов, каталазоположительна. Подобно прочим аэробам, синтезирует цитохромоксидазу (индофенолоксидаза), а оксидазный тест — один из ведущих при идентификации этой палочки. Синтезирует триметиламин, придающий культурам запах жасмина, винограда или карамели. Не нуждается в факторах роста. Способна расти на протяжении нескольких пассажей в чисто минеральной среде при добавлении подходящего единственного источника углерода. Ассимилирует ацетаты, пируваты, сукцинаты. Может утилизировать глюкозу, L-аланин при их содержании в среде не менее 0,5%.
Протеолитическая активность сильно выражена. Разжижает желатин, свертывает сыворотку крови, гидролизует казеин; утилизирует гемоглобин (большинство патогенных штаммов на кровяном агаре образует зону b-гемолиза). Синтезирует гиалуронидазу; гидролизует не только белки, но и отдельные аминокислоты (например, валин и аланин). Лизин и орнитин не декарбоксилирует; восстанавливает нитраты до нитритов и далее до молекулярного азота.
Сахаролитическая активность низкая; окисляет только глюкозу с образованием глюконовой кислоты.
Ввиду явного преобладания протеолитических свойств над сахаролитической активностью для идентификации синегнойной палочки среды Гисса для пестрого ряда готовят с малым содержанием пептона (до 0,1%) и повышенной концентрацией углеводов (до 2%). При посеве можно наблюдать, помимо четкой реакции с глюкозой, непостоянную ферментацию фруктозы и маннита. Тест Хью-Лейфсона положителен только с глюкозой (в аэробных условиях).
Пиоцины. Pseudomonas aeruginosa продуцирует бактериоцины — пиоцины (аэругеноцины); способность к синтезу и чувствительность к ним широко варьируют у различных штаммов, на чем основано пиоцинотипирование псевдомонад, применяемое для внутривидовой дифференциальной диагностики культур. Вирулентные штаммы либо активно продуцируют пиоцины, либо подвержены их действию. В основу метода положены следующие положения.
1. Пиоцины различных штаммов по-разному действуют на индикаторные штаммы.
2. Штамм-продуцент пиоцина резистентен к образуемому им бактериоцину.
3. Различные штаммы обладают разной чувствительностью к набору индикаторных пиоцинов.
4. Пиоцинотипирование используют при эпидемиологической оценке выделенных культур. Для разделения культур на пиоцинотипы используют два основных методических принципа.
– Типирование по продукции или активности пиоцинов в отношении набора индикаторных штаммов.
– Типирование по чувствительности штаммов к наборам известных индикаторных пиоцинов. Соответственно культуры получают наименования: «пиоцинотип» — штамм или культура, подверженная литическому воздействию определенного типа пиоцина; «пиоциногенотип» — штамм или культура, образующая определенный тип пиоцина.
Характерный и имеющий важное диагностическое значение признак (у 70-80% клинических изолятов). Среди пигментов наиболее часто встречают:
а. Водорастворимый феназиновый пигмент пиоцианин, окрашивающий питательную среду, отделяемое ран и перевязочный материал в сине-зеленый цвет. В анаэробных условиях пигмент обычно бесцветный, но даже встряхивание среды (частичная аэрация) приводит к появлению окраски.
б. Подавляющее большинство культур образует зеленый пигмент флюоресцеин, или лиовездин, флюоресцирующий при УФ-облучении (с длиной волны 254 нм); для обнаружения можно воспользоваться лампой Вуда.
в. Некоторые штаммы могут синтезировать и другие пигменты — пиорубин (красный), пиомеланин (черно-коричневый), L-оксифеназин (желтый).
г. Оптимальная температура для синтеза пигментов in vitro 30-37°С. Кроме того, необходимо дополнение сред глицерином, аминокислотами (особенно аланином), ионами (особенно Mg2+ и К+). Высоковирулентные штаммы отличает значительное образование пиоцианина, проявляющего свойства бактериоцина, действующего на грамположительные и грамотрицательные бактерии, а также имеющего умеренную фунгицидную активность.
д. При выделении культур иногда наблюдают атипичные непигментированные или слабопигментированные формы. Обычно их идентификация требует дополнительного тестирования, что усложняет диагностические исследования. Непигментированные штаммы составляют 8,3-18%, а 6-37% всех изолятов может быть пигментировано слабо.
Основные механизмы изменчивости культуральных признаков Pseudomonas aeruginosa — лизогенная конверсия и мутации.
Отсутствие или утрата способности к пигментообразованию также могут обусловливать сопутствующая микрофлора, действие антибиотиков, дефицит О2 или смена среды обитания с нарушением физиологических свойств бактерий, вызванных искажением белкового метаболизма в патологически измененных тканях, особенно при злокачественных новообразованиях.
Пиомеланин предохраняет микроорганизм от неблагоприятного действия изменений концентрации О2 и УФ-лучей. Его наличие также помогает бактериям переносить гипоксию при инфекциях глубоких тканей. Подобные свойства пигмента дают основание считать меланинобразующие штаммы более вирулентными.
По сравнению с Pseudomonas aeruginosa, подавляющее большинство микроорганизмов данной группы, обитая в почве и воде, имеют ограниченное клиническое значение (за исключением В. mallei и В. pseudomallei — возбудителей сапа и мелиоидоза соответственно). Высокая частота выделения и более выраженная патогенность Pseudomonas aeruginosa связаны с наличием у этого микроорганизма ряда факторов вирулентности, способствующих колонизации и инфицированию тканей организма человека. К детерминантам вирулентности относятся факторы, способствующие адгезии, инвазии, цитотоксичности.
Адгезия Pseudomonas aeruginosa к клеткам эпителия опосредуется ворсинками (пилями), которые обладают способностью специфически связываться с GM-1 ганглиозидными рецепторами эпителия. Секретируемый микроорганизмом фермент нейраминидаза, отщепляя остатки сиаловых кислот от рецептора, облегчает специфическую адгезию.
Локальное и системное действие на организм млекопитающих оказывают и другие секретируемые Pseudomonas aeruginosa ферменты. Фосфолипаза разрушает цитоплазматические мембраны эукариотических клеток, инактивирует опсонины, гидролизует сурфактант легких. Цитотоксическим действием (в том числе и в отношении макрофагов), а также способностью подавлять биосинтез белка обладает экзотоксин А. Биосинтез белка ингибируется также экзоэнзимом S. Эластаза (протеаза II) разрушает иммуноглобулины и компоненты комплемента, ингибирует активность нейтрофилов. Функцию нейтрофилов и лимфоцитов подавляет токсин – лейкоцидин. Цитотоксическим эффектом обладает и пигмент пиоцианин, обусловливающий сине-зеленую окраску среды при выращивании микроорганизма в культуре или гнойного отделяемого инфицированных ран.
Мощным индуктором системной воспалительной реакции является липополисахарид Pseudomonas aeruginosa. Часть штаммов продуцируют капсульный полисахарид альгинат. Штаммы, продуцирующие альгинат, обычно выявляются у пациентов с хроническими инфекциям. Альгинат способствует формированию на поверхности эпителия пленки, которая обеспечивает защиту патогена от воздействия факторов резистентности макроорганизма и антибиотиков.
Для Pseudomonas aeruginosa характерно разнообразие весьма тонких механизмов регуляции экспрессии факторов вирулентности. Активность механизмов регуляции направлена на быструю адаптацию микроорганизма к меняющимся условиям обитания и обеспечение максимальной экономичности с энергетической точки зрения. При пребывании микроорганизма во внешней среде факторы вирулентности не синтезируются, при попадании же во внутреннюю среду организма млекопитающих начинается интенсивный синтез этих белков, способствующих развитию инфекционного процесса. Сигналами для микроорганизма о попадании во внутреннюю среду могут быть изменения температуры, рН среды, контакт с мембраной эукариотических клеток. Распознавание таких сигналов осуществляют специфические рецепторы, локализованные в клеточной стенке микроорганизма. Передачу сигнала, обеспечивающего начало синтеза фактора вирулентности, от рецептора к гену, кодирующему белок, осуществляют двухкомпонентные системы передачи сигнала. Такие системы действуют по принципу последовательной активации ферментов в реакции фосфорилирования и являются универсальными в регуляции вирулентности микроорганизмов. У Pseudomonas aeruginosa описаны двухкомпонентные системы, регулирующие образованиe ворсинок и синтез экзоэнзимов. Кроме регуляции синтеза факторов вирулентности на уровне отдельных микробных клеток, у Pseudomonas aeruginosa регуляция происходит и на уровне популяции. Речь идет о феномене "кооперативной чувствительности" или "чувства кворума" (quorum sensing), заключающемся в накоплении в микробной популяции низкомолекулярных соединении (гомосеринлактонов), осуществляющих при достижении определенной концентрации депрессию синтеза большинства факторов вирулентности. Таким образом, экспрессия генов вирулентности оказывается зависящей от плотности микробной популяции. Биологический смысл феномена, вероятно, связан с координированным началом синтеза факторов вирулентности только после достижения микробной популяцией определенного уровня плотности. Регуляции на уровне кооперативной чувствительности у Pseudomonas aeruginosa подвержена экспрессия большинства факторов вирулентности и вторичных метаболитов.