В связи с этими данными возникают дополнительные проблемы, связанные с разработкой методов быстрой идентификации пастерелл различных видов. Вполне вероятно, что сложность их диагностики не позволяет расширить описываемую картину пастереллезной инфекции. Во всех случаях диагностика пастереллеза достаточно сложная. Она основана только на выделении чистой культуры и идентификации ее по бактериологическим тестам.
Weder D., Wolfson J. отмечают, что при первичной микроскопии пастереллезную папочку обнаруживают в мазках спинномозговой жидкости в 80% случаев, в суставной жидкости в 50% случаев, в плевральной жидкости больных в 20% случаев. При использовании коммерческих систем тестирования API Mistek, Oci/Ferm идентифицировали только 68%, 11% и 81% тестированных изолятов соответственно.
К настоящему времени становится ясно, что пастереллы следует включить в ряд бактерий, являющихся возможными этиологическими агентами тяжелых инфекционных болезней.
По классификации экспертов ВОЗ пастреллезы относятся к III и IV (из 7) группам повышенного риска, Данные группы определяют круг лиц, у которых больше всего шансов заболеть указанной инфекцией. К группе III (полевые работники) относятся люди, работающие на природе с дикими животными: лесники, охотники, рыбаки, натуралисты, экологи-исследователи, топографы, геологи, строительные рабочие (дамбы, шоссе, трубопроводы), а также туристы.
В группу IV (группа «досуга») включают лиц, имеющих контакт с комнатными или дикими животными в городских условиях: продавцы, владельцы животных и члены их семей и гости, а также работники зоопарков, заповедников, заказников и их посетители, ветеринары.
Фактором патогенности можно считать капсулу бактерий, защищающую их от действия микробицидного потенциала фагоцитов. Как фактор вирулентности рассматривают способность пастерелл связывать и утилизировать ионы Fe2+.
Основана на выделении и индикации возбудителя. В мазках из клинического материала выявляют грамотрицательные мелкие палочки, часто окрашивающиеся биполярно.
Хорошо растут на КА; колонии 1-2 мм в диаметре; большинство видов не проявляет гемолитической активности, но может вызвать окрашивание среды в зеленый или коричневый цвет. Колонии отличаются затхлым запахом плесени.
Питательные среды для культивирования пастерелл
Пригодны общепринятые плотные и жидкие питательные среды, однако при выделении из патологического материала следует применять среды, обогащенные кровью, сывороткой крови, дрожжевым экстрактом.
Идентификация Р. multocida сероварианта А с использованием гиалуронидазы стафилококка.
Метод основан на способности гиалуронидазы, выделяемой стафилококком, деполимеризовать капсулу Р. multocida сероварианта А, состоящую из гиалуроновой кислоты.
На поверхность агара Хоттингера в чашке Петри штрихом высевают суточную бульонную культуру Р. multocida. После этого перпендикулярно линиям посева по всему диаметру чашки петлей высевают суточную бульонную культуру Staphylococcus aureus. Чашки с посевами инкубируют при 37°С с периодическим просмотром в течение 24 ч. Деполимеризующее действие гиалуронидазы проявляется уменьшением размера колоний пастерелл и примыкающих к линии роста стафилококков. При просмотре чашек в косопроходящем свете колонии Р. multocida сероварианта А, находящиеся в непосредственной близости от линии роста стафилококка, тусклые, серого или голубого цвета, в то время как остальные колонии — яркие, флюоресцирующие. У колоний, образуемых другими серовариантами (В, D, Е), изменений в размерах и окраске не наблюдается.
Идентификация Р. multocida сероварианта D с использованием акрифлавина.
Испытуемую культуру высевают на агар Хоттингера с 10% крови быка или барана и инкубируют при 37°С 24 ч, затем пересевают в пробирки, содержащие 3 мл бульона Хоттингера. Инкубируют при 37°С 18-24 ч. Бульонные культуры переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют в режиме, обеспечивающем осаждение бактериальных клеток. После центрифугирования 2,5 мл надосадочной жидкости сливают, а в оставшейся ресуспендируют осевшие клетки и добавляют 0,5 мл свежеприготовленного водного раствора (1:1000 - 1:500) нейтрального акрифлавина (синий трипафлавин, флавакридин, флавин). Перемешивают и оставляют при комнатной температуре.
Если испытуемая культура относится к сероварианту D, то в течение 10-20 минут образуется крупнохлопчатый осадок. Штаммы других серовариантов (А, В, Е) в осадок не выпадают и сохраняют стабильность суспензии в течение длительного времени (от нескольких часов до суток и более).
Brucella — бактерии, представляют собой мелкие (0,5-0,7´0,6-1,5 мкм) неподвижные палочки или коккобациллы. В мазках обычно расположены одиночно, реже парами, короткими цепочками, небольшими группами. Легко окрашиваются анилиновыми красителями, грамотрицательны. Полноценного биполярного окрашивания обычно не обнаруживают. Настоящих капсул не имеют, спор не образуют. Неподвижны, жгутиков не образуют.
Хемоорганотрофы, метаболизм дыхательный; для роста необходимы тиамин, ниацин и биотин; рост часто стимулирует внесение пантотената кальция. Восстанавливают нитраты (исключая Brucella ovis); каталазоположительны и обычно оксидазоположительны, цитрат не утилизируют; индол не образуют; реакции с метиловым красным и Фогеса-Проскауэра отрицательные. Строгие аэробы (некоторые нуждаются в увеличении концентрации СО2 до 5-10%); растут в пределах 20-40°С (оптимальная температура 37°С); оптимум рН 6,6-7,4. Факультативные внутриклеточные паразиты; человек заболевает при непосредственном контакте с больным животным (доярки, скотники), а также при употреблении в пищу зараженных продуктов.
Патогенные для человека Brucella abortus (палочка Банга), В. melitensis, В.suis, В. canis и их биотипы вызывают бруцеллез (также известен как ундулирующая, средиземноморская, мальтийская лихорадка или болезнь Банга). Заболевание описывал еще Гиппократ, но как самостоятельную нозоединицу его предложил выделить Мерстон в 1860 г. Возбудитель бруцеллеза был открыт и выделен английским медицинским врачем Брюсом (1986,1887) из селезенки погибшего от этой инфекции солдата из гарнизона на Мальте и позднее назван Brucella melilensis. В 1904-1907 гг. Заммитом была установлена теснейшая связь инфекции людей и потреблением козьего молока и выявлено, что козы и козье молоко являются источником и резервуаром инфекции для людей. В 1897 датские ветеринарные врачи Банг и Стрибольт из околоплодной жидкости коровы выделили второй вид - Brucella abortus (палочка Банга). В 1914 г. Траумом, а затем в 1916 г. Гудом и Смитом выделен возбудитель инфекционного аборта свиней, названный позднее - В. suis. В 1918 году американская исследовательница Ивенс, изучив биологические и серологические свойства всех трех культур, установила их большое сходство. Результаты этих наблюдений были подтверждены Майером и Фезье (1920), которые и предложили объединить данные микроорганизмы в одну группу.
Резервуар и источник инфекции — домашние животные (овцы, козы, коровы, свиньи, реже собаки). Человек — вторичный хозяин; заболевания людей, исключая случаи лабораторного заражения, возникают на фоне эпизоотии. Бактерии передаются от животного к животным и человеку через контакт с зараженными фекалиями, мочой, молоком и мясом. Как правило, каждый из патогенных для человека видов бруцелл избирательно инфицирует специфических животных; Brucella abortus чаще вызывает бруцеллез у крупного рогатого скота (болезнь Банга), В. melitensis — у коз и овец (иногда кур), В. suis — у свиней. Резервуар отдельных биотипов последнего вида — также зайцы, а в районах Крайнего Севера РФ, на Аляске (США), северо-западных территориях и Юконе (Канада) источником заражения могут быть северные олени (карибу).
В США и РФ заболеваемость людей бруцеллезом носит, прежде всего, профессиональный характер. Возбудитель внедряется в организм человека через поврежденную кожу, слизистую оболочку дыхательных путей и ЖКТ, конъюнктиву. Контактный путь заражения более характерен для овечьего и свиного бруцеллеза.
В странах, где отсутствует массовая пастеризация молочных продуктов, бруцеллез более распространен. Например, в Испании ежегодно регистрировали около 100000 случаев бруцеллеза. Большинство из них вызвано употреблением в пищу зараженных молока и сыра.
Клетки отличаются выраженным полиморфизмом: в одном препарате наблюдаются кокки и удлиненные палочки (особенно в молодых культурах). Клетки Brucella melitensis чаще представлены кокковидными формами, В.abortus и В. suis — палочками с закругленными концами. Возможно наличие капсул у некоторых видов, выявляемых при культивировании на среде Дорсе, на средах, содержащих 10% иммунной сыворотки барана или лошади, а также при выращивании на куриных эмбрионах. Капсульные культуры можно получить и при воздействии специфическим бактериофагом.
Колонии видов Brucella мелкие, выпуклые и гладкие, мутноватые, с перламутровым оттенком (S-формы); первые генерации при посеве из органов развиваются довольно медленно (2 недели и больше), при пересевах лабораторных культур обычно достаточно 2-5 суток. В процессе диссоциации образуют шероховатые R-колонии. Нуждаются в сложных, обогащенных средах содержащих несколько аминокислот, тиамин, никотинамид и ионы магния. Brucella abortus дает оптимальный рост в атмосфере, содержащей 5-10% СО2. Рост бруцелл стимулирует внесение в питательную среду 5% глицерина или сыворотки. Сыворотка и кровь стимулируют рость, но гемин (Х-фактор) и НАД (У-фактор) влияния на рост не оказывают. Для выращивания обычно применяют триптозный, триптозо-казеиново-соевый и кровяной (5% овечьей крови) агар; оптимальная среда для культивирования — печеночный агар Хеддльсона. При выращивании для проверки диссоциации культур применяют 1% декстрозный агар с добавлением 2% глицерина (можно дополнить внесением 5% сыворотки).