Научно-методический центр пищевых инфекций методы частной бактериологии (стр. 4 из 55)
Рисунок 1. Принципиальная схема бактериологического выделения
возбудителя сибирской язвы
Bacillus cereus (от лат. cera — воск, свеча) широко распространена в природе, морфологически сходна с Bacillus anthracis (характерно расположение микробных тел в виде штакетника), но обладает подвижностью, чувствительна к действию g-фага бацилл и гемолизирует эритроциты барана. Вызывает спорадические случаи пищевых отравлений у человека. Температурный оптимум роста 30°С, оптимум рН 7-9,5. На МПА образует «распластанные» колонии с неровными краями; на КА колонии «распластанные», зернистые, с широкой зоной гемолиза, на яичном агаре образует широкую зону преципитации белого цвета (эффект бактериальной лецитиназы), зона быстро растет, и через несколько суток инкубации охватывает всю поверхность чашки. Колонии, выросшие на агаре, имеют характерный восковидный вид. На жидких средах бацилла образует белый хлопьевидный осадок, нежную пленку на поверхности и вызывает помутнение бульона. Следует отметить высокую протеолитическую активность микроорганизма — разжижает желатин в течение 1-4 сут (80% штаммов); все штаммы образуют лецитиназу и ацетилметилкарбинол, расщепляют до кислоты глюкозу и мальтозу, а часть штаммов — также и сахарозу, глицерин, лактозу, галактозу, инулин, дульцит и декстрин.
Bacillus cereus вызывает два типа пищевых отравлений (гастроэнтеритов); интоксикацию опосредует энтеротоксин, образуемый вегетирующими формами, прорастающими из спор устойчивых к определенным термическим режимам обработки пищевых продуктов (обычно овощей). Бациллы образуют токсины только in vivo, во время прорастания спор.
Первый тип отличает укороченный инкубационный период (около 4-5 ч), характерны изнуряющие диарея и рвота. Заболевание развивается при употреблении пищи, обсемененной большим количеством микроорганизмов. Часты случаи отравлений в связи с употреблением жареного риса, содержащего проросшие споры Bacillus cereus, эти случаи не менее часто ошибочно связывают с отравлениями стафилококковым энтеротоксином. Подобные отравления можно считать токсикозами (или гнилостной инфекцией), связанными не столько с активностью токсина, сколько с действием метаболитов, накапливающихся в пищевых продуктах.
Второй тип отравлений характеризует более продолжительный инкубационный период (около 17 ч); патогенез полностью опосредован действием энтеротоксина, больные жалуются на схваткообразные боли в животе, диарею; этот комплекс симптомов часто и ошибочно принимают за пищевые отравления, вызванные клостридиями.
Патогенез обоих типов отравления в большей или меньшей степени связан с действием энтеротоксина; механизмы его действия остаются до конца не изученными, но его активность не связана со стимуляцией аденилатциклазы.
Предрасполагающие факторы — различные нарушения иммунитета.
Вторичные иммунодефициты, вызванные применением цитостатиков и иммунодепрессантов, а также различными патологическими состояниями, сопровождаемыми иммунодепрессиями (например, острыми лейкозами), могут быть причиной тяжелых, часто фатальных инфекций Bacillus cereus с массированными бактериемиями, эндокардитами и менингитами.
Применение b-лактамных антибиотиков для подавления роста Bacillus cereus может вызвать бурный рост резистентных штаммов.
Протезы. Вероятность развития непищевых инфекций также велика у лиц с протезированными органами, катетерами, а также у пациентов с гемодинамическими нарушениями.
Диагностика
Диагностическим признаком считают обнаружение в подозрительных продуктах более 105 бактерий в 1 г/мл продукта либо 102-103 бактерий в 1 г/мл каловых и рвотных масс или промывных вод.
Включают Bacillus subtilis, В. megaterium, В. alvei, В. laterosporus, В. pumilus, В. thuringiensis и В. sphaericus. Два первых вида — широко распространенные сапрофиты, остальные виды — энтомопатогены. Они могут вызвать заболевания человека в составе микробных ассоциатов, особенно у лиц с иммунными расстройствами. Значительная часть героина, продаваемого уличными торговцами, обсеменена Bacillus sublilis, отсюда тяжелые глазные инфекции и бактериемии у наркоманов. Также следует упомянуть В.stearothermophilus, патогенную для насекомых и применяемую в качестве средства биологического воздействия в первую очередь на гусениц чешуекрылых (Lepidiptera). Механизм энтомоцидного действия связан со способностью образовывать белковые кристаллические структуры (гранулы) при спорообразовании, они высвобождаются при прорастании споры и выделяют бактериальные токсины под действием пищеварительных ферментов желудочно-кишечного тракта гусеницы.
Питательные среды для культивирования бактерий рода Bacillus
Среда ГКИ (Шляхов, 1973). К раствору Хенкса добавляют 40% (объем/объем) стерильной сыворотки крови крупного рогатого скота, инактивированной при 56°С 30 мин. Раствор Хенкса можно заменить бульоном Хоттингера (рН 7,2—7,4). Среду используют для обнаружения способности капсулообразования у В. anthracis.
Среда Томова (Шляхов, 1973). В состав среды входят 50 мл пептонного агара (10%-ный раствор агара, 2,5%-ный раствор пептона, 0,5%-ный раствор натрия хлорида), 100 мл сыворотки крови крупного рогатого скота, 50 мл куриного белка, 25 мл 0,4% гемина в 0,01 н растворе натрия гидроксида, 25 мл 0,01 н уксусной кислоты. В стерильной колбе смешивают сыворотку крови, белок, подогревают до 50°С и добавляют к расплавленному пептонному агару, имеющему температуру 50°С. Затем добавляют раствор гемина, уксусную кислоту, компоненты перемешивают и стерильно разливают в чашки Петри. На данной среде возбудитель сибирской язвы растет в S-или SM-форме. Среда обладает селективными свойствами: растут В.anthracis, В. cereus, не растут В. subtilis, В. megaterium, В. brevis, В. mycoides.
Среда Knisely (1966). К расплавленному питательному агару добавляют 40 мг/мл лизоцима, 30 ЕД/мл полимиксина, 300 мг/мл натриевой соли этилендиаминотетрауксусной кислоты (ЭДТА), 40 мг/мл таллия ацетата. Растворы предварительно стерилизуют фильтрацией. Устанавливают рН 7,35. Через 24-48 ч инкубирования при 37°С В. anthracis вырастает в виде мелких, гладких колоний. Другие виды бацилл на этой среде обычно не растут.
Лизоцимовая среда (Claus, Berkeley, 1986). Первоначально готовят раствор лизоцима, содержащий 10000 ЕД/мл в дистиллированной воде, и стерилизуют фильтрацией. 1 мл раствора лизоцима смешивают с 99 мл стерильного питательного бульона и разливают по 2,5 мл в пробирки. При изучении бацилл, патогенных для насекомых, 1 мл лизоцимового раствора (0,1%) смешивают с 99 мл полужидкого агара, который готовят следующим образом. В 1 л дистиллированной воды растворяют 10 г агара, 3 г Na2HPO4, по 5 г дрожжевого экстракта и триптона; фильтруют, устанавливают рН 7,3-7,5 и стерилизуют при 121°С 20 минут. Затем стерильно добавляют раствор глюкозы из расчета 2 г/л. Глюкозу предварительно стерилизуют в виде 10%-ного раствора при 115°С 20 минут. Используют для идентификации видов рода Bacillus.
Дифференциально-диагностическая среда. К 100 мл питательного агара, расплавленного и имеющего температуру 45—50°С, добавляют следующие растворы: 0,5 мл полимиксина М сульфата, 0,5 мл невиграмона, 1,0 мл гризеофульвина, 10 мл моющего средства «Прогресс», 0,1 мл натрия фенолфталеинфосфата. Компоненты перемешивают, разливают в чашки Петри. Среда пригодна 1—2 суток при хранении в условиях холодильника. Через 18—24 ч культивирования посевов в крышку чашки Петри вносят 1-2 мл 25%-ного водного раствора аммиака. Чашку выдерживают (крышкой вниз) при 20°С 1 минуту и учитывают результат. Колонии бактерий с фосфатазной активностью розовеют, остальные колонии, в том числе В. anthracis, остаются бесцветными. Среда обладает селективными свойствами.
Приготовление растворов. Полимиксина М сульфат растворяют в физиологическом растворе с расчетом 10000 ЕД/мл. Невиграмон растворяют в 25%-ном водном растворе аммиака, затем разводят стерильным 0,9%-ным раствором натрия хлорида до концентрации 100 мкг/мл. Моющее средство «Прогресс» разводят стерильной дистиллированной водой до концентрации 0,1%. Гризеофульвин растирают в ступке, растворяют в стерильной дистиллированной воде до концентрации 100 мкг/мл. Натрия фенолфталеинфосфат (коммерческий 10%-ный раствор) прогревают на водяной бане при 56°С 30 минут. Среду используют для выделения из загрязненного материала возбудителя сибирской язвы.
Среда Буза (Шляхов, 1973). К 3%-ному голодному (без пептона) агару (рН 7,2-7,4) добавляют 15% дефибринированной крови барана. Используют для культивирования возбудителя сибирской язвы.
Селективный агар для выделения и идентификации В. cereus (Hoibrook, Anderson, 1980). В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 1 г пептона, 10 г маннита, 2 г натрия хлорида, 0,1 г магния сульфата, 2,5 г Na2HPO4, 0,25 г КН2РО4, 0,12 г бромтимолового синего, 10 г натрия пирувата, 14 г агара. Стерилизуют автоклавированием при 121°С 15 минут. К расплавленному и охлажденному до 50°С агару добавляют стерилизованный фильтрацией раствор полимиксина В на дистиллированной воде из расчета конечного содержания 100 ЕД в 1 мл среды. Компоненты перемешивают и среду разливают в чашки Петри. Типичные колонии В. cereus диаметром около 5 мм с характерным синеватым оттенком (расщепление маннита), окружены зоной преципитации желточной эмульсии аналогичного цвета. По этим признакам В. cereus можно отличить от других бацилл, кроме В. thuringiensis. Изменение желточного компонента в среде вызывают также S. aureus, S. marcescens, P. vulgans, но они имеют другую форму колоний и зону просветления вокруг них.
Жидкая среда обогащения для выделения В. cereus (Claus, 1955). В 100 мл дистиллированной воды растворяют 10 г KNO3, 5 г пептона, 3 г мясного экстракта. Устанавливают рН 7,0, стерилизуют при 120°С 15 минут. Исследуемый материал предварительно прогревают при 80°С 10 минут. Через 24 ч инкубирования при 30°С одну бактериологическую петлю засевают на питательный агар с желточной эмульсией. Культивируют при 37°С для подавления роста В. mycoides.