Вид с неясным систематическим положением. Выделен при сепсисе, артритах, менингитах, миозитах, пневмониях и маститах овец. Грамотрицательные коккобактерии или полиморфные палочки, до неправильной формы нитевидных клеток. Неподвижные, некислотоустойчивые. Некоторые штаммы образуют капсулу.
На кровяном агаре при 5-10% СО2 формирует выпуклые, просвечивающие колонии диаметром 0,5-1,6 мм, возможен рост в аэробных условиях. Несмотря на отсутствие четкой потребности в ростовых факторах, лучше растет на шоколадном агаре, не дает роста на агаре Мак-Конки.
Вид с неясным систематическим положением. Обитает в генитальных органах здоровых жеребцов, возможно длительное носительство у кобыл в области клитора. Возбудитель эндометритов и цервицитов у кобыл.
Клетки имеют форму мелких, грамотрицательных, иногда биполярно окрашенных палочек, коккобактерий, нитей. Некислотоустойчивы, неподвижны, образуют капсулу. Температурный оптимум 37-38°С. Плохо растет в аэробных и анаэробных условиях, оптимальным является содержание 5-10% СО2 в атмосфере. Рост на питательных средах стимулируется Х-фактором. На шоколадном агаре формирует через 24 ч единичные, мелкие (около 1 мм), круглые, выпуклые, блестящие колонии серо-белого цвета. При надавливании бактериологической петлей колонии скользят по поверхности среды. Гемолитической активностью не обладает. Плохо растет на кровяном, сывороточном агаре, не растет на агаре Мак-Конки.
Остальные виды рода Haemophilus, по современным данным, не играют роли в патологии сельскохозяйственных животных.
Питательные среды для культивирования гемофильных бактерий
Среды для выращивания гемофильных бактерий должны содержать специальные ростовые факторы. Для этого в основную среду крови добавляют свежий стерильный экстракт дрожжей или чистые препараты ростовых факторов: V- , Х-фактор.
Шоколадный агар. Содержит Х- и V-факторы. Агаровую питательную среду (МПА, агар Хоттингера) расплавляют на водяной бане и, не охлаждая, добавляют в нее 10—15% по объему стерильной дефибринированной или нитратной крови лошади, барана или кролика. После охлаждения питательной среды до 55—60°С содержимое сосуда тщательно перемешивают и разливают по чашкам или пробиркам.
Агар Левинталя. Содержит Х- и V-факторы. Готовят при изучении морфологии колоний, так как шоколадный агар непрозрачен. В этом случае к расплавленной и затем охлажденной до 60°С агаровой среде добавляют, встряхивая, 10% стерильной дефибринированной или цитрированной крови барана или лошади. Кровь добавляют дробно (5—7 раз) при тщательном перемешивании питательной среды, флакон с которой в промежутках выдерживают на водяной бане с температурой 65°С. После внесения всего объема крови питательную среду нагревают до кипения и оставляют в кипящей воде в течение 5 минут. Затем среду вынимают из водяной бани и 2-3 минуты выдерживают при комнатной температуре. Процедуру прогрева среды повторяют три раза. Далее питательную среду ставят на 2 ч на водяную баню при температуре 60°С для осаждения темных хлопьев свернувшейся крови. По истечении указанного срока осторожно, стараясь не взмучивать осадок, верхнюю прозрачную часть агара разливают по пробиркам или чашкам Петри.
Сывороточно-дрожжевой агар. Содержит V-фактор. К расплавленному МПА или агару Хоттингера (рН 7,2-7,4) добавляют 5-10% стерильной сыворотки крови лошади, крупного рогатого скота, овцы, кролика и такое же количество дрожжевого экстракта.
Приготовление дрожжевого экстракта. 250 г прессованных пекарских дрожжей суспендируют до образования гомогенной суспензии в 1 л дистиллированной воды. Суспензию в колбе из термостойкого стекла кипятят в течение 4—5 минут, непрерывно перемешивая. Микробную массу осаждают центрифугированием при 3-4 тыс. об/мин в течение 30 минут. Надосадочную жидкость сливают и стерилизуют, пропуская через стерилизующие пластины фильтра Зейтца. Полученный таким образом дрожжевой экстракт хранят в посуде из темного стекла при 4-5°С и используют в течение 8-10 суток после изготовления.
Среда с баккормилкой. Метод применяется для культивирования видов, рост которых зависит от наличия в среде V-фактора. Исследуемый материал (или изучаемую культуру) засевают газоном на сывороточной или кровяной МПА, можно на агар Хоттингера в чашки Петри. После этого по диаметру чашки крестообразно в виде непрерывной линии бактериологической петлей засевают «питающую» культуру бактерий. Чаще используют Е. coli или Staphylococcus albus, не обладающие гемолитическими свойствами. Эти виды бактерий в процессе роста выделяют V-фактор, который диффундирует в толщу агаровой среды. В зоне диффузии V-фактора, вблизи питающей культуры, так называемой «баккормилки», способны расти колонии гемофильных бактерий (сателлитный рост), нуждающиеся в V-факторе.
Среды с добавлением чистых препаратов Х- и V-факторов. Используют препарат гемин (Х-фактор) и НАД (V-фактор). В питательную среду (плотную, жидкую) вносят растворы гемина, НАД или оба препарата, в зависимости от ростовых потребностей бактерий. При этом учитывают, что НАД термолабилен, его необходимо стерилизовать фильтрацией и добавлять в охлажденную до 45°С среду, а гемин термостабилен и выдерживает автоклавирование.
Среды с селективными свойствами используют для выделения гемофильных бактерий из загрязненного патологического материала.
Среда Controni с соавт. (1972). Предназначена для культивирования Х- и V-фактор -зависимых видов бактерий. На чашке Петри с кровяным агаром (5% крови овцы) засевают по всей поверхности исследуемый материал. Затем на питательную среду помещают бумажный диск, пропитанный раствором, содержащим 5% сапонина и 2 ЕД бацитрацина. Сапонин разрушает эритроциты, вокруг диска образуется зона гемолиза, и из крови, находящейся в агаре, освобождаются фактор Х и V-фактор, которые обеспечивают рост гемофильных бактерий. Бацитрацин подавляет рост бацилл.
Среда Chapin с соавт. (1983). Состоит из шоколадного агара, содержащего 5 мкг/мл ванкомицина, 300 мкг/мл бацитрацина и 1 мкг/мл клиндамицина. Данная среда неблагоприятна для различных видов бактериальных контаминантов. Высеваемость гемофильных бактерий (Н. influenzae) в 10 раз выше, чем на обычном шоколадном агаре.
Среда Gilbride с соавт. (1983). Обладает ингибирующим действием на наиболее часто встречающиеся контаминанты (Е. coli, P. haemolytiса, Р. multocida, S. faecalis, S. aureus). Представляет собой триптозную среду с дрожжевым экстрактом, содержащую 1 мкг/мл кристаллвиолета, 1 мкг/мл линкомицина, 8 мкмг/мл спектиномицина, 128 мкг/мл бацитрацина.
Среда Pijoan с соавт. (1983). Рекомендуется использовать для подращивания Н. pleuropneumoniae перед высевом на плотную среду. Состоит из сердечно-мозгового бульона с 5% лошадиной сыворотки, 5% дрожжевого экстракта, 100 мкг/мл ДПН, 0,5 мкг/мл линкомицина и 1,5 мкг/мл бацитрацина.
По данным Т. Little (1970), получены положительные результаты при выделении Н. pleuropneumoniae из контаминированного материала на шоколадном МПА, содержащем 1:25 000 кристаллвиолета и 1,6 ЕД бацитрацина.
Микроорганизмы рода Campylobacter
Микроорганизмы, объедененные в данный род, включают 13 видов. Они известны с 1909 г, со времени выделения в Англии Мак Федиеном и Штокманом культуры C.fetus из эмбрионов при инфекционных абортах овец. Позднее, у КРС эту культуру выделили Смит и Тейлор (США, 1918). В СССР заболевание впервые диагносцировано у коров, в 1926 В. Якимовым. Морфологически это спиральные, S-oбpaзные или изогнутые в виде запятой, «крыла чайки» бактерии; размеры которых — 0,5-5,0 ´ 0,2-0,8 мкм, могут иметь один и более витков и достигать длины 8 мкм. При культивировании более 48-72 ч образуют кокковидные формы. Подвижные, обладают характерным «винтообразным движением», подвижность обусловлена наличием жгутика, расположенного на одном или двух полюсах (могут в 2-3 раза превышать длину клетки). Спор не образуют; хемоорганотрофы, у большинства видов метаболизм дыхательный. Углеводы не ферментируют и не окисляют, не образуют кислых и нейтральных конечных продуктов метаболизма, энергию получают расщеплением аминокислот и интермедиатов цикла Кребса. Оксидазоположительны, редуцируют нитраты. Патогенные для человека виды капнофилы (необходимая концентрация СО2 10-15%) и микроаэрофилы (необходимая концентрация О2 3-15%) Некоторые могут также расти и в аэробных условиях (21% О2), другие, например, С. fetus subsp. fetus, способны к росту в анаэробных условиях. Для роста в микроаэробных условиях некоторые виды нуждаются в ионах Н+ и формиатах. Некоторые виды растут в анаэробных условиях в присутствие фумарата, либо фумарата + формиата, формиата и Н+. Грамотрицательны, но водные и спиртовые растворы анилиновых красителей воспринимают с трудом, для идентификации их обычно окрашивают карболовым фуксином Циля (в разведении 1:5). Типовой вид — С. fetus. Род включает виды, патогенные да человека и теплокровных животных, вызывают поражения известные как кампилобактериозы. Обычно их выделяют из органов мочеполовой системы, кишечника и ротовой полости. Виды, патогенные для человека и вызываемые ими поражения, представлены в табл. 21, дифференциальные признаки — в табл. 22. Среди них наибольшее медицинское значение имеет С. jejuni, чья патогенность для человека, как возбудителя пищевой токсикоинфекции, была установлена сравнительно недавно (1972 г).
Группа Campylobocter jejuni (С. jejuni, С. coli, С. lari)
Температурный оптимум 42°С; оптимум рН 7,0-7,2; для создания микроаэрофильных условий в анаэростате замещают 75% воздуха смесью из 90% азота и 10% СО2 Оптимальную газовую среду получают с помощью коммерческих газогенераторных пакетов (например, Campy Pak II); удовлетворительный рост можно получить в анаэростате со свечой. В полевых условиях используют стерильные пластиковые пакеты, в которые вносят чашку, засеянную исследуемым материалом, и чашку, засеянную чистой культурой любого факультативного анаэроба (например, эшерихиями); последние будут поглощать О2 и выделять СО2 в процессе роста. Кампилобактерии плохо переносят транспортировку; при наличии опыта можно проводить непосредственную их идентификацию в образцах фекалий; в противном случае их следует помещать в консервант, например, тиогликолевый бульон (рН 8,5) или щелочную пептонную воду, содержащую 0,05% тиогликолята Na и 0,025% цистеина, и хранить при температуре 4°С. Для получения более чистых культур используют метод фильтрации через мембранные фильтры (диаметр пор 0,65 мкм), основное достоинство метода — возможность посева фильтрата на неселективные среды (например, КА или ША), основной недостаток — возможность больших потерь бактерий, но обычно ее не принимают во внимание, т.к. 1 г фекалий больного содержит 107-108 жизнеспособных кампилобактерий.