Научно-методический центр пищевых инфекций методы частной бактериологии (стр. 46 из 55)
Распространенность
Лептоспирозы человека и животных выявляют практически повсеместно в самых разнообразных климато-географических и ландшафтных зонах. Заболеваемость также тесно связана с деятельностью человека (сельскохозяйственные работы, скотоводство и т.д.).
Основной резервуар инфекции — различные дикие и домашние животные (более 80 видов), включающие жвачных, хищников, грызунов и рукокрылых. Из домашних животных особенно часто болеют свиньи, крупный рогатый скот; реже — собаки.
Пути передачи. Механизм передачи возбудителя сходен у всех лептоспирозов; основной магистралью для заражения человека и животных служит вода. Возбудитель сохраняется в почках больного животного и выводится с мочой, которой могут быть загрязнены водоемы, почва, растительность и пищевые продукты. Человек заражается при проведении сельскохозяйственных работ, например при покосах, в низинах при проведении ирригационных и мелиоративных работ, а также при купании и использовании воды из загрязненных водоемов. Реже регистрируют случаи инфицирования при контактах с животными и через пищевые продукты; в свежем молоке возбудитель выживает до 2 суток, в картофельном супе — до 11 суток, в заливной рыбе и холодце — до 24 ч. Поскольку заражение через воду считают доминирующим, выделяют три основных фактора эпидемиологии лептоспирозов: первично-исходные природные очаги; антропургические очаги (преимущественно сельскохозяйственные) и больные люди (обычно тупиковые хозяева). Случаев заражения человека через укусы членистоногих (слепни, мухи-жигалки) не описано, однако получены вполне убедительные экспериментальные данные, указывающие на способность кровососущих насекомых и клещей сохранять (до месяца) и передавать лептоспиры.
Сезонность. Очаги лептоспироза характеризует определенная полигостальность (множественность хозяев), однако роль разных животных в поддержании очага весьма разнообразна, при непрерывной циркуляции наибольшую зараженность грызунов наблюдают в июле-сентябре, наименьшую — в январе-апреле. Соответственно, у человека пик заболеваемости приходится именно на эти периоды.
Патогенез поражений
В организм лептоспиры проникают через слизистые оболочки носа, рта пищевода (но не желудка, где они обычно погибают), глаз, а также через микротравмы кожных покровов; чаще наблюдают комбинированное заражение (через слизистые оболочки и кожу). Продвигаясь по лимфатическим путям лептоспиры обычно не вызывают развития лимфаденитов (исключая случаи японской семидневной лихорадки с характерным увеличением регионарных лимфатических узлов). Затем возбудитель проникает в кровь и циркулирует в ней, генерализованная лептоспиремия продолжается 4-5 суток со дня заражения и сопровождается избирательной концентрацией возбудителя в почках и печени (5-6 суток). Соответственно, гепаторенальные поражения характерны для всех лептоспирозов и особенно для болезни Васильева-Beйля. Начиная со 2 недель, возбудитель депонируется преимущественно в извитых канальцах почек и исчезает из крови и других тканей
Поражения печени обусловлены как механическим повреждением гепатоцитов активно подвижными лептоспирами, так и токсическим действием метаболитов и продуктов распада микроорганизмов, что может приводить к развитию желтухи. Определенная роль в происхождении желтухи принадлежит массивному гемолизу, опосредованному множественными кровоизлияниями вследствие повреждения эндотелия сосудов лептоспирами.
Поражения почек. Способность возбудителя избирательно депонироваться, располагаясь на поверхности эпителиальных клеток и в межклеточном пространстве, приводит к тяжелым повреждениям почечных канальцев и нарушению мочеобразования, а в тяжелых случаях к анурии и уремии. После выздоровления лептоспиры длительно сохраняются в почках и выделяются с мочой (до 40 дня болезни).
Поражения сосудов. Механическое воздействие лептоспир на эндотелий сосудов вызывает множественные кровоизлияния, нарушает проницаемость сосудистой стенки с потерей жидкости вплоть до развития гиповолемического шока. В свою очередь, массивные кровоизлияния и прогрессирующая тромбоцитопения могут вызвать развитие ДВС-синдрома.
Менингеальные явления, часто наблюдаемые при лептоспирозах, связаны с непосредственным действием микроорганизмов и продуктов их распада на ЦНС; в СМЖ лептоспиры регулярно обнаруживают с 7 по 15 сутки болезни.
Клинические проявления достаточно вариабельны — от бессимптомных (субклинических) до тяжелых желтушных форм.
Лабораторная диагностика
Включает бактериологические и серологические исследования (рис. 20). При проведении исследований необходимо учитывать эпизоотические, эпидемиологические предпосылки (сезонность, контакт с собаками, свиньями, грызунами и др.).
Микроскопия крови наиболее эффективна в первые дни заболевания; проводят темнопольную микроскопию либо исследуют мазки, окрашенные по Романовскому-Гимзе. Количество лептоспир, циркулирующих в крови, невелико. Необходимо микроскопировать несколько образцов, либо предварительно отцентрифугировать исследуемый образец (эффективность прямой микроскопии не превышает 10%), более адекватные результаты может дать заражение лабораторных животных или выделение гемокультуры.
Биологическая проба. Проводят внутрибрюшинное заражение морских свинок (массой 150-200 г) 2-3 мл крови, взятой в первые дни заболевания (до появления желтухи), через 48-72 ч проводят микроскопию брюшинного экссудата и крови, а также наблюдают за животными и отмечают повышение температуры тела и появление желтухи. Павших животных подвергают патогистологическому и микроскопическому исследованию.
Выделение гемокультуры проводят в первые 2-4 сутки. 8-10 мл венозной крови засевают отдельными порциями на 6-10 пробирок со средой Ферворта-Вольфа, пробирки энергично встряхивают для предупреждения сворачивания крови, заливают жидким парафином и инкубируют при температуре 28-30°С. Через каждые 4-5 суток культуры исследуют, при отсутствии роста в течение 15-20 суток желательно сделать пересевы на свежую среду. Наиболее часто положительные результаты получают при посевах крови, взятой в 1-2 сутки. Начиная с 4 дня, высеваемость резко падает. На 2-3 неделе возбудитель можно обнаружить в моче и СМЖ, используя все упомянутые методы.
Рисунок 20. Принципиальная схема бактериологического выделения возбудителей лептоспирозов
Серологические исследования проводят на 2-3 неделе заболевания, ставят РСК, реакции микроагглютинации и лизиса с сывороткой пациента и стандартным набором микроорганизмов; при положительном результате можно видеть образование клубков из лептоспир (специфичной считают реакцию при титре не ниже 1:400) или возникновение «зернистого» распада бактерий. Реакции необходимо ставить повторно для выявления нарастания титров AT.
Питательные среды для культивирования лептоспир
Водно-сывороточная среда. Разлитый во флаконы фосфатный буферный раствор (рН 7,2-7,4) автоклавируют при 115°С 30 минут. К охлажденному буферному раствору добавляют 5-10% инактивированной при 56-58°С в течение 1 ч сыворотки крови кролика или барана, фильтруют через фильтр Зейтца и разливают в пробирки. Для проверки на стерильность среду выдерживают при 37°С в течение 3-5 суток.
Среда Ферворта-Вольфа в модификации Тарасова. К 900 мл дистиллированной воды добавляют 0,5 мл хлорида натрия, 1 г пептона, 100 мл фосфатного буферного раствора (рН 7,2) и автоклавируют при 115°С 30 минут. Полученную смесь дважды фильтруют через бумажный фильтр, разливают по 5 мл в пробирки и автоклавируют при 115°С 30 минут. В каждую пробирку вносят по 0,5 мл стерильной сыворотки крови кролика или барана, прогревают при 56-58°С 30 минут. Для проверки на стерильность среду выдерживают при 37°С в течение 3-5 суток.
Полужидкая среда Флетчера. К 1000 мл дистиллированной воды добавляют 2 г агара и кипятят 30 минут. Затем разливают по 5 мл в пробирки и автоклавируют при 0,8 атм. 30 минут. После охлаждения в каждую пробирку вносят по 0,5 мл стерильной сыворотки крови кролика или барана, инактивируют при 56-58°С 30 минут. Проверяют на стерильность в течение 3-5 суток при 37°С.
Это бактериальные клетки с характерным свойством кислотоустойчивости являются свободноживущими или паразитами позвоночных. Виды данного рода могут быть ошибочно приняты за другие близкие роды. Свойство кислотоустойчивости, обусловленное присутствием восков в клеточных стенках, особенно важно для типирования микобактерий. Эти бактерии не обесцвечиваются под действием подкисленного спирта или сильных неорганических кислот после окрашивания. Некоторые другие бактерии частично кислотоустойчивы, они легко обесцвечиваются спиртом, но могут быть устойчивы к действию слабой кислоты.
В состав рода Mycobacterium включены кислото- и спиртоустойчивые (признак особенно выражен у паразитических видов) аэробные неподвижные грамположительные прямые или изогнутые палочковидные бактерии. Иногда они образуют нитевидные или мицелиальные структуры, фрагментирующиеся при легком механическом воздействии на палочки или кокковидные элементы. Характерно высокое содержание липидов и восков (до 60%) в клеточных стенках, образованных пептидогликано-арабиногалактановым комплексом; некоторые виды образуют каротиноидные недиффундирующие пигменты. Каталазо- и арилсульфатазоположительны; резистентны к действию лизоцима. Растут медленно или очень медленно, видимые колонии появляются через 2-60 суток при оптимальной температуре. Колонии часто розовые, оранжевые или желтые, особенно при росте на свету. Пигмент не диффундирующий, поверхность колоний обычно матовая или шероховатая (сапрофитные виды растут несколько быстрее). Характерные биохимические признаки медленнорастущих патогенных микобактерий представлены в табл. 23. Микобактерии широко распространены в окружающей среде — воде, почве, на растениях и животных. Несмотря на то, что в настоящее время идентифицировано около 50 видов, некоторые авторы считают, что род насчитывает около 200 паразитических и сапрофитных видов; типовой вид — Mycobacterium tuberculosis. По признаку патогенности выделяют собственно патогенные, вызывающие конкретные заболевания, и атипичные микобактерии. Для систематики последних предложены различные классификации, основанные на генетическом сходстве с Mycobacterium tuberculosis или сходстве с сапрофитными видами; среди предложенных вариантов наибольшее распространение нашла классификация Раньона (1959), в основу которой положены два свойства — цвет колоний и скорость роста. Она выделяет 5 групп микобактерий — патогенные (Mycobacterium tuberculosis, M.leprae, M. bovis, M. microti и М. lepraemurium) и 4 группы атипичных микроорганизмов: