Научно-методический центр пищевых инфекций методы частной бактериологии (стр. 49 из 55)
При незначительном содержании возбудителя можно использовать метод накопления по Уленгуту — материал смешивают с равным или двойным объемом смеси NaCI и NaOH, энергично встряхивают и инкубируют 30 минут при температуре 21°С Затем клеточный детрит и посторонние бактерии (в виде супернатанта), разрушившиеся под действием щелочи, удаляют центрифугированием; осадок нейтрализуют 30% раствором уксусной кислоты и готовят мазки, окрашиваемые по Цилю-Нильсену или Киньону.
Более эффективен метод флотации — в материал вносят раствор NaOH, дистиллят и ксилол (бензол) и энергично длительно встряхивают, образующаяся пена всплывает и захватывает микобактерий; ее отсасывают и готовят мазки.
Определенную ценность в оценке тяжести процесса, эффективности лечения и прогноза заболевания имеет количественная оценка популяции микобактерий методом Гаффки-Стинкена (подсчет бактерий на калиброванных стеклах в определенных полях зрения). Наиболее результативный бактериоскопический метод — люминесцентная микроскопия, т. к. окраска флюорохромом (например, аурамин-родамином) позволяет выявлять даже незначительное количество микобактерий (окрашиваются в бело-желтый цвет), а также формы с измененными культуральными и тинкториальными свойствами.
Выделение возбудителя
Перед посевом исследуемый материал можно обработать по Уленгуту или Сумиоши (15-20% раствором НСl или H2SO4), исследуемые образцы центрифугируют, отмывают физиологическим раствором и засевают, тщательно втирая, на твердые питательные среды (обычно Левенштайна-Йенсена). Для простоты можно обработать образцы различными антибиотиками, подавляющими рост контаминирующей флоры. Недостаток метода — длительность получения результата от 2 до 12 недель; достоинство — возможность получения чистой культуры, что позволяет ее идентифицировать, оценить вирулентные свойства и определить чувствительность к лекарственным препаратам.
Разработаны ускоренные методы выделения возбудителя (например, Прайса): материал помещают на предметное стекло, обрабатывают H2SO4, отмывают физиологическим раствором и вносят в питательную среду, дополненную цитратной кровью. Стекло вынимают через 3-4 суток и окрашивают по Цилю-Нильсену.
Биологическая проба
«Золотой стандарт» в диагностике туберкулеза — биологическая проба на морских свинках, зараженных подкожно или внутрибрюшинно 1 мл материала, полученного от больного.
У животных развивается генерализованная инфекция, приводящая к смерти через 1-2 месяца; однако заболевание можно распознать раньше постановкой проб с туберкулином — через 3-4 недели после заражения, а лимфадениты обнаруживают уже на 5-10 сутки. Пунктаты последних содержат значительное количество микобактерий.
Появление в последние годы резистентных (особенно изониазид-устойчивых) или измененных микобактерий снизило чувствительность биологической пробы. Для ее повышения применяют интратестикулярное заражение либо подавляют иммунитет организма животных введением глюкокортикоидов.
Рисунок 21. Принципиальная схема бактериологического выделения возбудителей туберкулеза
Серологические исследования
Предложено большое количество различных реакций, выявляющих Аг микобактерий и AT к ним, например РСК, РА, РПГА по Бойдену, агрегатагглютинации и др.; однако они либо не обладают необходимой специфичностью, либо требуют дифференциальной диагностики при получении ложноположительных реакций с Аг и AT к другим микобактериям.
Кожные пробы с туберкулином
Имеют особую значимость, т.к. позволяют проводить широкомасштабные скрининговые обследования населения; метод включает внесение небольших доз ППД-Л (новый туберкулин Коха) в кожные насечки (реакция Пирке), внутрикожно (реакция Манту) и подкожно (реакция Коха). При положительном результате через 48 ч (у пожилых лиц — через 72 ч) в месте введения формируется папула диаметром 10 мм с гиперемированными краями. В большинстве стран наиболее распространена проба Манту, т.к. результаты реакции Пирке часто вызывают затруднения при их интерпретации.
Положительная реакция Манту указывает на контакт лица с Аг Mycobacterium tuberculosis или других бактерий, дающих перекрестную реакцию; положительный результат нельзя рассматривать как признак активного процесса.
При появлении папулы меньших размеров (5-10 мм) результат считают сомнительным, и рекомендовано повторить пробу с введением 10 ЕД. При еще меньших размерах папулы реакцию считают отрицательной; следует помнить, что отрицательная реакция Манту не всегда указывает на отсутствие процесса, т.к. у больных с иммунодефицитами реакция обычно также отрицательна.
Дополнительные лабораторные методы
Включают оценку иммунного статуса пациента, что имеет прогностическое значение, т.к. у больных с дефектами Т-лимфоцитов прогноз хуже.
Лечение
Разработка средств лечения туберкулеза — важная страница в истории бактериологии, ставшей трагедией всей жизни Роберта Коха. В 1890 г. он доложил на Х Международном съезде врачей о терапевтической эффективности экстракта убитых туберкулезных бактерий, названного им туберкулин (старый туберкулин), и опубликовал сообщение в «Deutsche Medizinische Vochenschrift». Значимость открытия была так велика, что автор был награжден орденом Красного Орла (чего не удостаивался ни один медик). Однако широкое применение препарата показало, что он не только не излечивал, но и активизировал латентный процесс, что вызвало бурную критику в прессе. Следует отметить, что и в настоящее время арсенал специфической химиотерапии остается небольшим, особенно учитывая способность микобактерий к развитию резистентности. Противотуберкулезные средства разделяют на препараты первого ряда и альтернативные средства.
Первая группа включает изониазид, этамбутол, стрептомицин, пиразинамид, рифампицин: комбинация из двух препаратов обычно позволяет преодолеть химиорезистентность возбудителя.
Альтернативные средства — канамицин, циклосерин, парааминосалициловая кислота (ПАСК), этионамид, виомицин, капреомицин и тиоацетазон.
Лечение активного туберкулеза требует проведения интенсивной терапии, при положительных результатах выделение возбудителя прекращается в среднем в течение 2-4 недель, и больного можно выписать из стационара, но лечение следует проводить не менее года.
Профилактика туберкулеза
Включает соблюдение элементарных правил гигиены, а также проведение специализированных мероприятий по диспансеризации больных лиц и широкомасштабному профилактическому обследованию населения.
При положительной кожной пробе и отсутствии признаков активного процесса назначают изониазид курсом до года.
Иммунопрофилактика включает внутрикожное введение аттенуированного штамма Mycobacterium bovis (штамм Лейт-Нокар-Альфор), известного как бацилла Кальметта-Герена (БЦЖ).
Возбудитель туберкулеза крупного рогатого скота, вызывает 5% случаев туберкулеза у человека. Морфологические отличия от Mycobacterium tuberculosis не выражены, микобактерии бычьего типа несколько короче, с менее выраженной склонностью к ветвлению. Культуральные свойства также сходны; однако на искусственных средах растут медленно и только при температуре 37°С, в глицерине не нуждаются. В первичных культурах и на средах, не содержащих пируват, отмечают скудный рост; колонии мелкие, плоские, шероховатые. Принципы выделения аналогичны таковым для микобактерий человеческого типа (рис. 21). Основными методами дифференциальной диагностики с Mycobacterium tuberculosis считают ниациновый тест и биологическую пробу на кроликах (кролики резистентны к заражению М. tuberculosis). Возбудитель — рекордсмен по числу возможных хозяев и выявлен у 60 видов млекопитающих, но эпидемическую опасность для человека представляют крупный рогатый скот (наибольшее значение), верблюды, козы, овцы, свиньи, собаки и кошки. Больные животные выделяют микобактерии с молоком, мокротой, мочой и калом: человек заражается при контактах с больным животным или при употреблении сырого молока, или (реже) плохо обработанного мяса. В сливочном масле возбудитель может сохраняться до 240 суток, в сыре — до 200 суток.
Основной возбудитель туберкулеза в Африке, морфологически и культурально сходен с Mycobacterium bovis; идентифицирован Кастетсом с соавторами (1968-1969) при изучении вспышки туберкулеза в Западной Африке. Истинное распространение возбудителя определить сложно, т. к. во многих лабораториях его не идентифицируют либо путают с М. bovis, во всяком случае, при обследовании более чем 7000 больных туберкулезом в Великобритании выявлено свыше 90 случаев инфицирования М. africanum.
Мycobacterium avium
Возбудитель туберкулеза птиц. Бактериальные клетки тонкие, от коротких до длинных, иногда ветвятся. Оптимум температуры 38-41°С, рН 6,8-7,3. На питательных средах растет быстрее (10-20 дней), чем М. bovis и M. tuberculosis.
На плотных яичных средах растет в виде гладкого маслянистого налета. Колонии округлые, слизистые, мягкие, серовато-белые, с возрастом могут желтеть. Могут иметь пуговицеобразное возвышение с кратерообразным углублением. При первичной изоляции из патологического материала колонии плоские и полупрозрачные. Бактериальная масса легко суспендируется в физиологическом растворе. В жидких питательных средах возбудитель дает диффузный рост, на поверхности формируется влажная жирная пленка, на дне рыхлый осадок. Вид антигенно неоднороден. Дифференцируют три серовара. Серовар 2 отличается большой патогенностью для кур (Molmsky, Schaeter, 1973).