Кроме больных птиц, может быть изолирован из лимфатических узлов и пораженных тканей крупного рогатого скота, свиней и других животных. В эксперименте при внутривенном заражении кур обусловливает заболевание с летальным исходом в течение месяца, реже позднее. На вскрытии у павших кур обнаруживают очаги в печени и селезенке. У зараженных внутривенно кроликов развивается септический процесс, и они гибнут на 11-30-е сутки. После подкожного заражения у морских свинок наблюдают изменения (абсцесс) на месте инъекции.
В соответствии с «Наставлением по диагностике туберкулеза животных» (1986) бактериологическое исследование предусматривает микроскопическое исследование препаратов, окрашенных по методу Циля-Нельсена, люминесцентную микроскопию, выделение культуры посевом материала на стерильные питательные среды (Петраньяни, Гельберга, Левенштейна-Иенсена). Выделенные культуры идентифицируют с учетом скорости появления первичного роста, культурально-морфологических и тинкториальных свойств, способности к росту при различных температурных режимах (20-25, 37-38, 45°С) на разных питательных средах (яичные, яичные с салицилатом натрия, МПБ). Проводят биопробу с целью обнаружения возбудителя в испытуемом материале или определения видовой принадлежности выделенной культуры микобактерий. Вид подопытного животного определяется целью исследования (морские свинки, куры, кролики).
Мycobacterium paratuberculosis
Возбудитель паратуберкулеза. Болеют крупный рогатый скот, овцы, козы и другие виды домашних и диких животных. Клетки палочковидной формы, размером 0,6-2,0 ´ 0,2-0,5 мкм, окрашиваются равномерно, однако в удлиненных клетках могут наблюдаться неоднородные по тинкториальным свойствам участки. В старых культурах возможно наличие кокковидных или удлиненных форм. В мазках из патологического материала характерно расположение клеток кучками, в виде «палисада».
Культивирование затруднительно. Поэтому в питательные среды добавляют, особенно при первичной изоляции, ростовой фактор — микобактин (0,03 мкг/мл). Остальные микобактерии продуцируют его самостоятельно. Препарат микобактина можно заменить экстрактами из микобактерий других видов, которые вносят в питательную среду в количестве 1-4%. Наибольшее количество ростового фактора содержится в экстрактах из М. phlei (Twort, Ingram, 1913).
Аэроб, температурный оптимум 38°С. В жидких питательных средах растет с образованием нежной, беловатой пленки (через 3-4 месяца культивирования становится толще и опускается на дно пробирки). На плотных питательных средах макроскопически видимый рост появляется через 1,5-2 месяца. Колонии сухие, сморщенные, беловато-серого или желтого цвета
Мycobacterium intracellulare
Изолируют при ограниченных поражениях у свиней, крупного рогатого скота и туберкулезоподобной патологии у людей.
Наряду с перечисленными видами в природе обитают микобактерии, не вызывающие патологию у животных, но способные сенсибилизировать организм и обусловливать положительные реакции на туберкулин. К этой группе микобактерии относятся следующие виды: M.xenopi, M.ulcerans, М. haemophilum, М. farcinogenes, М. malmoense, М. asiaticum, М. gordone, М. szulgai, М. shimoidei, М. simiae, М. serofuiaceum, М. microti, М. kansassii, М. nonchromogenicum и др.
Питательные среды для культивирования патогенных микобактерий
Среда Петраньяни. В стерильную колбу со стеклянными шариками вносят 250 мл свежего цельного молока, 6 г картофельной муки, 1 г пептона, одну мелко нарезанную картофелину размером с куриное яйцо. Помешивая, выдерживают колбу с содержимым в кипящей водяной бане 10 минут, охлаждают до 60°С и вносят один желток и содержимое 4 свежих куриных яиц, 12 мл стерильного глицерина, 6 мл 2%-ного (на дистиллированной воде) раствора малахитового зеленого. Компоненты перемешивают, фильтруют через двойной слои марли, разливают по стерильным пробиркам и свертывают в наклонном положении в аппарате Коха при 85°С 30 минут. В последующие двое суток прогревают при 75°С по 15 минут. Готовая среда светло-зеленого цвета. Хранят на холоде.
Среда Левенштейна-Иеисена. Готовят солевой раствор следующего состава. В 600 мл дистиллированной воды растворяют первоначально 2,4 г одноосновного фосфата калия, далее последовательно 0,24 г сульфата магнезии, 0,6 г цитрата магнезии, 3,6 г L-аспарагина, 12 г химически чистого глицерина. Раствор стерилизуют текучим паром 120 минут, добавляют 30 г картофельного крахмала, разливают в колбы по 150 мл и нагревают в кипящей водяной бане до загустения смеси.
Затем готовят яичную массу. В литровую стерильную колбу с бусами асептично вносят содержимое 20-22 куриных яиц (свежих), перемешивают, фильтруют через марлю. К 1000 мл яичной смеси добавляют 20 мл стерильного 2%-ного раствора малахитового зеленого и перемешивают.
К 1 л яичной смеси с малахитовым зеленым добавляют 600 мл солевого раствора с крахмалом, выдерживают около одного часа до исчезновения пузырьков, асептично разливают по 8-10 мл в пробирки и в скошенном положении в аппарате Коха прогревают при 80-85°С 40 минут. Далее выдерживают в термостате для контроля стерильности. Хранят на холоде. Если среду используют для определения лекарственной устойчивости микроорганизмов, крахмал не добавляют.
Яичная среда Гельберга. Пять свежих куриных яиц моют, обтирают спиртом, слегка обжигают, вскрывают. Асептично извлекают два желтка и помещают их в стерильную колбу с бусами, встряхивают. Добавляют 50 мл солевого раствора, 50 мл молока, 50 мл картофельного отвара, 2,5 мл 10%-ного стерильного раствора лимонной кислоты. Компоненты перемешивают, добавляют 3,5 мл 2%-ного раствора малахитового зеленого и вновь содержимое колбы тщательно перемешивают. Смесь фильтруют через стерильную марлю и по 4-6 мл разливают в пробирки. Стерилизуют в аппарате Коха при 85°С 60 минут однократно. Готовую питательную среду для контроля стерильности выдерживают 48 ч в термостате. Используют в течение недели после изготовления при хранении на холоде.
Приготовление картофельного отвара. Очищенный и нарезанный картофель заливают двойным (по весу) количеством воды, кипятят 15 минут, отстаивают, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают в колбы по 110 мл и стерилизуют при 120°С 20 минут.
Приготовление молока. Снятое коровье молоко разливают по 110 мл в колбы, стерилизуют первый день при 105°С 10 минут и второй — 15 минут текучим паром.
2%-ный раствор малахитового зеленого стерилизуют при 120°С 20 минут. 10 г кристаллической лимонной кислоты растворяют в 100 мл дистиллированной воды, разливают по 10 мл в пробирки и стерилизуют 20 минут при 120°С.
Приготовление солевого раствора. Берут К2НРO4 — 1 г, натрия лимоннокислого — 1 г, магнезии сернокислой — 1 г, пептона — 6 г, глицерина химически чистого — 30 мл, воды дистиллированной — до 1000 мл. Каждый компонент растворяют в небольшом количестве воды, потом вносят глицерин и добавляют дистиллированную воду до 1000 мл. Смесь слегка подогревают, фильтруют через бумажный фильтр, разливают в колбы по 110 мл и стерилизуют 20 минут при 105°С.
Картофель Павловского. Белый картофель тщательно моют с мылом, насухо вытирают, очищают, прокаленным ножом срезают оба полюса картофелины. Специальным стерильным бором вырезают из картофеля цилиндры длиной 5—6 см, шириной в соответствии с диаметром пробирки. Цилиндры по диагонали разрезают на два клина и опускают последние в 5%-ную стерильную глицериновую воду на 1-2 ч. Далее клинья подсушивают при помощи стерильной фильтровальной бумаги и пинцетом опускают в пробирки Ру с перетяжкой, содержащие в нижней части 5%-ную стерильную глицериновую воду (рН 7,0-7,2), с расчетом, чтобы нижняя часть картофельного клина касалась жидкости. Пробирки стерилизуют при 110°С 10 минут. Сразу после стерилизации пробирки размещают в наклонном положении поверхностью посевов вниз, что позволяет сохранить их влажными. Стерильность контролируют выдерживанием пробирки в термостате в вертикальном положении двое суток. Хранят на холоде.
Среда Петрова. Приготавливают компоненты. Смешивают 500 г мясного говяжьего фарша с 500 мл 15%-ной глицериновой воды и выдерживают 24 ч на холоде. Перед употреблением фильтруют.
Асептически извлекают содержимое куриных яиц, помещают в мерный цилиндр и перемешивают. Далее готовят 1%-ный спиртовой раствор генцианвиолета и выдерживают 24 ч в термостате. Для изготовления среды в 1 часть мясного настоя вносят 2 части яичной смеси и 1 мл раствора генцианвиолета на каждые 100 мл среды. Компоненты тщательно перемешивают, разливают по пробиркам и прогревают первый день при 85°С, а два последующих дня — при 75°С по 45-60 минут. Готовую среду контролируют на стерильность, выдерживая в термостате 3-5 дней.
Яично-картофельная среда Виноградова. Вымытый, очищенный и нарезанный мелкими кусочками картофель заливают водой (1:2) и варят при 120°С 1,5 ч. Горячий отвар фильтруют через марлю. В фильтрат вносят 1% пептона, 0,5% натрия хлорида, 5% глицерина. Смесь стерилизуют в автоклаве и используют по мере необходимости. При изготовлении среды к 1 части картофельного отвара добавляют 2 части яичной смеси, перемешивают, разливают по пробиркам и прогревают при 90°С. Затем в каждую пробирку вносят 0,5-1,0 мл МПБ с глицерином или картофельного отвара и повторно стерилизуют при 100°С два дня по 45 минут.
Среда Дорсе. Вымытые куриные яйца помещают на 10-15 минут в сосуд с этиловым спиртом, затем обжигают на пламени горелки, содержимое асептично переносят в колбу с известным весом и доливают 10% (вес/вес) дистиллированной воды. Смесь тщательно перемешивают, фильтруют через стерильную марлю, разливают по пробиркам и свертывают в наклонном положении при 70-75°С 60 минут. Контролируют на стерильность, выдерживая 3 суток в термостате.