Среда Международной лиги борьбы с туберкулезом (MIUT). Среда Левенштейна-Иенсена без крахмала. Пробки в пробирках герметизируют парафином, хранят при 4°С. Среда пригодна для использования в течение полугода.
Кислотная яичная среда No1a (Zaher, Marks, 1977). В 600 мл дистиллированной воды растворяют 6,3 г КН2РO4, 0,3 г MgSO4 ´ 7Н2O, 12 мл глицерина и автоклавируют при 110°С 15 минут. К раствору асептически добавляют 1100 мл полной яичной смеси, 3 мл 1 н НСl, 11 мл раствора малахитового зеленого (2%-ный вес/объем) и 100 000 ЕД натриевой соли пенициллина. Среду разливают по пробиркам, прогревают при 75-85°С 45 минут.
Кислотная яичная среда No1b. Готовится аналогично среде No1а, вместо глицерина добавляют 7 г натрия пирувата.
Кислотная яичная среда No2а (Zaher, Marks, 1977). В 600 мл дистиллированной воды растворяют 2,4 г КН2РО4, 0,3 г MgSO4 ´ 7H2O, 12 мл глицерина, автоклавируют при 110°С 15 минут. Солевой раствор асептично смешивают с 1000 мл полной яичной смеси, добавляют 40 мл 1 н НСl, 10 мл раствора малахитового зеленого (2%-ный раствор вес/объем) и 100 000 ЕД натриевой соли пенициллина.
Кислотная яичная среда No2b. Готовится аналогично среде No2а, глицерин замещают 7 г натрия пирувата.
Кислотные яичные среды предназначены для выделения возбудителя туберкулеза из материалов, подвергнутых обработке различными способами. Для посева высокощелочных инокулятов рекомендуются среды No 1а и 1b, нейтральных и кислых — No 2а и 2b, без добавления НСl (Zaher, Marks, 1977).
Глицериновый МПБ. К МПБ добавляют 5-10% химически чистого глицерина, рН 7,2, стерилизуют при 110°С. На основе глицеринизированного МПБ, добавляя агар-агар, готовят глицериновый МПА.
Синтетическая среда Сотона. В 940 мл дистиллированной воды растворяют 0,5 г двухосновного фосфорнокислого калия, 0,5 г сернокислой магнезии, 0,05 г лимоннокислого аммиачного железа, 2 г лимонной кислоты, 4 г аспарагина, 60 мл глицерина химически чистого.
Кровяная среда. Непосредственно перед посевом дистиллированной водой 1:2-1:3 разводят стерильную нитратную кровь, разливают по 3 мл в пробирки и вносят раствор пенициллина из расчета 2 ЕД/мл (Тогунова, 1973).
Синтетическая среда Вишневского. Берут 3 г аспарагина, 7 г щавелевокислого аммония, 5 г двухосновного фосфорнокислого калия, 0,5 г сернокислого магния, 0,05 г сернокислого железа, 40 мл глицерина и дистиллированной воды до 1000 мл. Подщелачивают до рН 6,8-7,2, фильтруют через бумажный фильтр и стерилизуют 30 минут при 120°С.
Среда Данкина. Используют для культивирования М. paratuberculosis. На 4%-ном глицериновом бульоне выращивают 10-15 суток культуру М. phlei. Путем фильтрации через бу мл мажный фильтр отделяют бактериальную массу, переносят ее в ступку с 10 мл глицерина и 100 мл печеночного экстракта Дедляу. Смесь несколько минут кипятят, отстаивают и надосадочную жидкость сливают в мерный сосуд, добавляют содержимое трех куриных яиц. Перемешивают и вносят 2,5% (объем/объем) 1%-ного спиртового раствора генцианвиолета. Фильтруют через стерильную марлю, разливают по пробиркам и помещают в аппарат для свертывания. Стерилизуют дробно, первый день при 80°С до уплотнения среды и два дня подряд по 60 минут при 80°С.
Печеночный экстракт по Дедляу. В 1000 мл воды вносят 400 г говяжьей печени, стерилизуют 120 минут текучим паром и фильтруют через марлю. Устанавливают рН 7,0. Фильтрат разливают по емкостям и стерилизуют при 100°С по 20 минут в течение 3 дней.
Среда Ренжара. Используют для культивирования М. paratuberculosis. Смешивают 4 части печеночного (рН 7,3) и 8 частей телячьего бульона (рН 7,3), добавляют 3% агар-агара. После растворения агара смесь фильтруют, вносят 5% глицерина и 1 часть глицериновой вытяжки из М. phlei, стерилизуют при 115°С 20 минут. Среду охлаждают до 55°С. Добавляют 1 часть сыворотки крови крупного рогатого скота, прогретой при 56-58°С, разливают по пробиркам и окрашивают.
Приготовление вытяжки из М. phlei. Бактериальную массу М. phlei, выращенную на глицериновом бульоне, фильтруют через бумажный фильтр. 5 г биомассы растирают с 30 мл 20%-ного раствора глицерина в дистиллированной воде, встряхивают, прогревают при 110-120°С 1,5 ч. Центрифугированием отделяют жидкую часть, которую и используют для изготовления среды.
Микоплазмы (или молликуты), бактерии без клеточной стенки. Клетки ограничены только трехслойной цитоплазматической мембраной и неспособны к синтезу пептидогликана. Соответственно, эти микроорганизмы устойчивы к пенициллину и его аналогам, угнетающим синтез пептидогликана, но чувствительны к лизису, вызываемому осмотическим шоком, детергентами, спиртами. Большинство видов — факультативные анаэробы; представлены мелкими (0,1-0,45 мкм) клетками, характеризующимися выраженным плеоморфизмом; могут образовывать кокковидные, ветвящиеся и более крупные многоядерные формы, способные образовывать псевдомицелий. Обычно размножаются бинарным делением, подобно большинству бактерий, особенно после образования мелких кокковидных образований (элементарные тельца) в нитевидных структурах. Также способны к почкованию и сегментации. Включают подвижные и неподвижные виды, грамотрицательны (лучше окрашиваются по Романовскому-Гимзе), нуждаются в стеролах и нативном белке. На плотных средах образуют характерные мелкие колонии с приподнятым центром («яичница-глазунья»), имеющие тенденцию врастать в среду; морфология колоний достаточно специфична — на поверхности располагаются крупные, часто вакуолизированные клетки, в глубине — мелкие оптически плотные организмы. Вызывают адсорбцию, агглютинацию и лизис эритроцитов. У человека и животных выделяют представителей родов Mycoplasma, Ureaplasma и Acholeplasma, включающих патогенные и сапрофитные виды. В частности, человек — естественный хозяин 12 видов микоплазм — М. buccale, M.fermentans, М. hominis, М. pneumoniae, М. genitalium, М. lipophilum, М. orale, М. faucium, М. primatum и М. salivarium. Представители других родов — Ureaplasma urealyticum и Acholeplasma laidlаwaii — патогенны для человека.
Первые патогенные микоплазмы обнаружены Нокаром, Ру, Бореллем и др. (1893-1898), выделившими возбудителя контагиозной перипневмонии крупного рогатого скота (в настоящее время классифицирован как М. mycoides), полное морфологическое описание возбудителя проведено Борде (1910) и Бореллем с соавторами (1910), М.Г. Тартаковский и Е.П. Джунковский позднее разработали способы его культивирования. Первоначально все сходные возбудители плевропневмониеподобных поражений были объединены в группу PPLO (pleuropneumonia-like organisms), первые патогенные для человека микоплазмы были выделены из абсцессов бартолиниевых желез Диенесом и Эдзаллом (1937), а также Итоном от больного атипичной пневмонией (1944). Однако изучить возбудитель не представилось возможным, и он длительное время был известен как агент Итона. Тем не менее, окончательная этиологическая роль М. pneumoniae в развитии пневмоний была установлена лишь в 1962 г. Род образуют хемоорганотрофные организмы, у большинства видов метаболизм бродильный, основным источником энергии обычно служит глюкоза или аргинин. Подавляющее большинство составляют подвижные факультативные анаэробы, также растущие в аэробных условиях (иногда рост стимулирует внесение 5% СО2). Микроорганизмы растут при температуре 22-41°С (оптимальная 36-37°С); оптимум рН 6,8-7,4. Микоплазмы широко распространены в природе, включают много видов, патогенных для растений и животных; некоторые входят в состав микробных ассоциаций организма человека; 5 видов патогенно для человека — М. pneumoniae, M. hominis, M. genitalium, М. incognitus и M. fermentans. Типовой вид рода — M. mycoides.
Клетки характеризует выраженный полиморфизм, что обусловлено отсутствием ригидной клеточной стенки; по данным разных авторов, их средний размер варьирует в пределах 0,1-1,2 мкм. В ранней экспоненциальной стадии сферические или овальные, позднее удлиняются - вплоть до разветвленных нитей. Клеточная мембрана находится в жидкокристаллическом состоянии (ее молекулы способны перемещаться), средняя толщина 0,07-0,1 мкм; включает белки (идентичны белкам цитоплазмы, состоят из 17 аминокислот), мозаично погруженные в 2 липидных слоя, основной компонент которых — холестерин.
Микроорганизмы не способны к образованию холестерина (и прочих стеринов) и потребности в нем восполняют утилизацией его из тканей или питательной среды, дополненной его внесением.
Холестерин стабилизирует мембрану клетки, придает ей эластичность и обусловливает проникновение и утилизацию жирных кислот.
Стерины детоксифицируют жирные кислоты, способные вызвать гибель клетки, и служат субстратом для получения энергии.
Адсорбцию на клетках обеспечивают адгезины белковой природы и нейраминидаза, входящие в состав клеточной мембраны микоплазм.
Микоплазмы прихотливы к условиям культивирования, в питательные среды необходимо вносить нативную сыворотку, холестерин, нуклеиновые кислоты, углеводы, витамины и различные соли. Подходящие основы для них — триптический перевар сердца крупного рогатого скота (например, среды, разработанные В.Д. Тимакиным и Г.Я. Каган), перевар Хоттингера, пептон Мартена и др.; также широко применяют среду Эдварда. При их отсутствии для первичного выделения также пригодны куриные эмбрионы; гибель последних наблюдают с 3-5 пассажа. Чувствительны к микроэлементному составу среды — высокое содержание Zn2+, Mg2+, Co2+ и Fe2+ может ингибировать рост.
На твердых средах образуют характерные мелкие колонии (0,2-1,5 мм) с более темным и зернистым центром типа «яичницы-глазуньи», напоминающие мелкие колонии L-форм бактерий. На средах, содержащих кровь, некоторые виды дают a- и b-гемолиз, преимущественно обусловленные образованием перекисей; на средах, содержащих значительное количество сыворотки, могут образовывать преципитаты в их глубине. Обычно колонии появляются на 5-7 сутки (адаптированные штаммы растут быстрее).
На полужидких средах растут по уколу, формируя дисперсные, крошковатые колонии.