Научно-методический центр пищевых инфекций методы частной бактериологии (стр. 8 из 55)
Лабораторная диагностика
Возбудитель обычно обнаруживают в месте проникновения в организм больного. Поэтому наиболее рационально исследование различного материала, взятого в месте ранения. В тех случаях, когда входные ворота неизвестны, следует тщательно осмотреть больного для выявления ссадин, царапин, катаральных и воспалительных процессов, необходимо обратить внимание на старые рубцы после ранения, т.к. возбудитель может долго в них сохраняться; в некоторых случаях исследуют слизь из носа, бронхов, глотки, налет с миндалин, а также выделения из влагалища и матки (при послеродовом столбняке или аборте). При бактериологическом исследовании трупов также принимают во внимание возможность генерализации инфекции. Для анализа забирают кровь (10 мл) и кусочки печени и селезенки (20-30 г).
Выделение возбудителя проводят по стандартной схеме (рис. 3) Исследованию подлежит материал от больного или трупа, перевязочный и шовный хирургический материал, а также почва, пыль и воздух.
Рисунок 3. Схема бактериологической идентификации Clostridium tetani
Биологическая проба. При исследовании материала от больного или трупа параллельно бактериологическому анализу проводят обнаружение столбнячного анатоксина в биологической пробе на мышах. Для этого материал измельчают, добавляют двойной объем физиологического раствора, инкубируют в течение часа при комнатной температуре, фильтруют, часть фильтрата смешивают с противостолбнячной сывороткой из расчета 0,5 мл (200 АЕ/мл) сыворотки на 1 мл экстракта и инкубируют 40 минут. Затем одной группе животных вводят экстракт без предварительной инкубации с сывороткой, а другой группе — проинкубированную смесь, при наличии Clostridium tetani у животных первой группы развиваются симптомы столбняка.
Clostridium botulinum — возбудитель ботулизма, тяжелой, часто фатально заканчивающейся пищевой токсикоинфекции. В России первое клинико-эпидемиологическое описание ботулизма привел Зенгбуш (1818); возбудитель открыл ван Эрменген (1869).
Распространение
Clostridium botulinum широко распространены в почве. Заболевание регистрируют повсеместно, исключая районы вечной мерзлоты. Наиболее часто заболевания вызывают типы А и В, тип G первично выявлен в Аргентине, а тип Е более распространен в регионах, включающих большие естественные водоемы, — Северной Японии, области Великих озер (США, Канада), Швеции, Дании, Британской Колумбии (Канада), РФ, где бактерии настолько обильно колонизируют придонный ил, что отмечаются случаи заражения рыб. Периодическое пересыхание водоемов стимулирует рост Clostridium botulinum. Для профилактики интоксикаций продуктами промышленного производства при консервировании мяса широко применяют нитриты; в этом плане наибольшую опасность представляют мясные, рыбные и овощные консервы домашнего приготовления.
Естественный резервуар и источник инфекции — почва и различные животные.
Морфология возбудителя
Вегетативные клетки — палочки с закругленными концами размером 4-8´0,6-0,8 мкм, подвижны (перитрихи). При неблагоприятных условиях образуют эндоспоры, расположенные терминально и субтерминально. Строгие анаэробы; молодые культуры окрашиваются грамположительно, 4-5-суточные — грамотрицательно. Оптимум рН для роста 7,3-7,6, для прорастания спор 6,0-7,2.
Морфология колоний. На кровяном агаре с глюкозой образуют очень мелкие сероватые или мутные желтоватые колонии линзообразной формы (на различных средах у одного и того же штамма могут варьировать). Вокруг колонии образуются зоны гемолиза различной ширины. На печеночном агаре образуют полиморфные звездчатые колонии, на желатине — сероватые, окруженные зоной разжиженного желатина. На столбике агара можно обнаружить диссоциаты, R-формы имеют форму чечевичных зерен, S-формы — пушинок. Хорошо растут на жидких средах (обычно на бульоне Тароцци, бульонах из гидролизатов казеина, мяса или рыбы) при условии предварительного удаления О2 из среды кипячением в течение 15-20 мин с быстрым охлаждением. Вызывают помутнение среды и газообразование, иногда имеется запах прогорклого масла, но этот признак непостоянен.
Антигенный состав
Серологическая идентификация Clostridium botulinum основана на выявлении токсинов, по их структуре бактерии разделяют на 8 сероваров — А, В С1(a), С2(b), D, Е, F и G. Антигенная структура бактерий остается малоизученной, показано наличие жгутиковых, группоспецифических (Н) и соматических, типоспецифических (О) Аг, не проявляющих токсических свойств. Оптимальная температура для токсинообразования вариабельна для бактерий типов А, В, С и D 35°С, для бактерий типов Е и F 28-30°С
Биохимические свойства
Все типы Clostridium botulinum образуют желатиназу, лецитиназу и Н2S, проявляют широкий спектр сахаролитической активности (бактерии типов А, В, Е и F ферментируют глюкозу, левулезу, фруктозу, мальтозу и сахарозу типов С и D — глюкозу и мальтозу, тип G инертен к углеводам). Clostridium botulinum типов А и В обладают выраженными протеолитическими свойствами, разлагают свернувшийся яичный белок и гидролизуют желатин По биохимическим свойствам выделяют 4 группы.
Бактерии I группы проявляют выраженные протеолитические свойства, гидролизуют желатин и эскулин, ферментируют глюкозу и мальтозу, проявляют липазную активность на яичном агаре.
Бактерии II группы проявляют сахаролитическую активность, но лишены протеолитической.
Бактерии III группы проявляют липазную активность и гидролизуют желатин.
Бактерии IV группы гидролизуют желатин, но, в отличие от прочих возбудителей ботулизма не проявляют сахаролитических свойств и липазной активности, что послужило основанием для предложения выделить их в отдельный вид —Clostridium argentiense.
Патогенность
Патогенность Clostridium botulinum различна для различных видов млекопитающих; заболевания человека вызывают бактерии типов А, В, Е и F; Clostridium botulinum типов С и D вызывают заболевания животных и птиц (в редких случаях от больных животных выделяют бактерии типов А и В). Патогенность типа G для человека и животных не доказана.
Клинические проявления преимущественно обусловлены действием нейротоксина (т.к. в условиях организма размножение вегетативных форм Clostridium botulinum затруднено) и включают:
· классическую пищевую токсикоинфекцию, более распространенную под названием «ботулизм»;
· раневой ботулизм (возникает при загрязнении некротизированных тканей почвой);
· ботулизм новорожденных (у детей от 3 до 20 недель), характерны генерализованная гипотония и амиотрофия, развивается при заглатывании спор с последующим развитием вегетативных форм (в США ежегодно регистрируют около 70 случаев);
· неопределенно классифицируемый ботулизм (у детей старше одного года и взрослых), не связанный с указанными факторами риска (пища, рана).
Фармакокинетическая активность токсинов различных типов Clostridium botulinum практически одинакова: все они сорбируются на клетках слизистой оболочки кишечника, проникают в кровь (где их можно выявить серологически) и в периферические нервные окончания. Фармакологическое действие включает связывание Н-цепи токсина с мембраной, поглощение токсина и формирование пор в синаптических пузырьках (каждую пору формируют 4 молекулы токсина), что приводит к блокированию слияния синаптических пузырьков с мембраной; мишень для действия — интегральные синаптические белки. В частности, токсины серотипов В, D и F расщепляют синаптобревин, А и Е — SNAP-25, С — синтаксин, D и F — целлюбревин. Избирательно поражают a-моторные нейроны передних рогов спинного мозга, что обусловливает характерные параличи мышц. Токсины термолабильны, но для полной инактивации требуется кипячение в течение 20 минут.
Клинические проявления. Временной интервал между попаданием токсина в организм и появлением первых признаков ботулизма обычно не превышает 24 ч, но может варьировать от 4-6 до 96 ч и более. Проявления зависят от природы продукта, ставшего причиной отравления, количества токсина, поступившего в организм, и состояния больного. Первые, но непостоянные признаки — расстройства ЖКТ (тошнота, рвота, боли в животе). Часто больные жалуются на сухость во рту или гиперсаливацию. Одновременно развиваются головная боль и нервно-паралитические явления — нарушение глотания, дисфагия и офтальмоплегический синдром; часто наступают односторонний или двусторонний блефароптоз и анизокория — результат поражения сфинктера зрачка. Циркуляция токсина в кровотоке приводит к уменьшению притока крови к правому предсердию. Кроме поражения ЦНС, ботулотоксин вызывает периферические поражения нервно-мышечной передачи, проявляющиеся сначала вялостью движений или полной адинамией с последующим развитием парезов и/или параличей глазных, глоточных и гортанных мышц, а также мышц шеи и конечностей.
Довольно часто случаи детского ботулизма связаны с кормлением детей медом. Первый такой случай зарегистрирован в 1943г.; симптоматика раневого ботулизма аналогична таковой при пищевом отравлении и обусловлена действием токсина, выделяемого бактериями в ране.
Токсин Clostridium botulinum — белок, оказывающий нейротоксическое действие. В зависимости от типа возбудителя, идентифицируемого по антигенной структуре токсина, Mr может варьировать от 60 до 150 кД. Представлен Zn2+-зависимыми эндопептидазами, при протеолизе разлагается на 2 связанных дисульфидной связью фрагмента (L- и Н-цепи). Механизм биологической активности реализуется через связывание Н-цепи с мембраной, проникновение токсина в клетку, формирование пор в пузырьках (каждую пору формируют 4 молекулы токсина), что приводит к блокированию слияния синаптических пузырьков с мембраной. Токсин разрушается при кипячении, легко кристаллизуется в белый хлопьевидный порошок. Токсины всех типов также оказывают гемолизирующее действие.