работа «Биологические компьютеры» (стр. 5 из 9)

3.) Если же устанавливается активизирующая связь, то наличие или отсутствие входных данных заблокирует или позволит ответ от mRNA (логическая операция значения истины) (рис. 2-1с).

4.) Пример генной DNF-сети показан на рис.2-1d.

Молекулярный оператор 1 – мРНК флуоресцентного белка ZsYellow с мишенями для siRNA-A, siRNA-C и siRNA-E в UTR участках (мРНК1).

Молекулярный оператор 2 – мРНК того же белка, только UTR область содержит мишени для siRNA-НЕ(А) и siRNA-B (мРНК2).
Если, к примеру, A, C и E присутствуют, то соответствующие siRNA будут блокированы и трансляция светящегося белка будет идти с мРНК1. Хотя siRNA-НЕ(A) будет активной и подавит трансляцию белка ZsYellow с мРНК2, общий результат операции (мРНК1) ИЛИ (мРНК2) будет оценен как ИСТИНА.

2.3 Устройство молекулярного автомата для КНФ выражений

Биологическая цепь, которая предполагает только второй подход, включает в себя виды mRNA, которые производят фактор считывания информации, подавляющий кодирующий выходные данные ген. Принцип основан на использовании молекул мРНК, кодирующих белки-репрессоры LacI и LacI-KRAB (рис.2-2).

Репрессоры – это белки, которые, связываясь со своей мишенью на ДНК в промоторно-операторной области (месте старта синтеза мРНК), препятствуют образованию мРНК.

Репрессор LacI выделен из бактерии E.сoli, a KRAB – из клеток человека. Связывание LacI (или LacI-KRAB) репрессора с операторной областью LacO, расположенной перед геном, кодирующим выходной белок (здесь – dsRed), препятствует образованию его мРНК и, следовательно, самого белка (в данном случае флуоресцирующего красным белка dsRed). Рассмотрим, предлагаемые ниже, схемы (рис. 2-2).

a – схема, иллюстрирующая операцию И между двумя молекулами мРНК. Стрелка вниз в таблице истинности указывает на отсутствие мРНК. CAG – последовательность, кодирующая сигнал старта для синтеза продукта. LacO – мишень для репрессоров LacI и LacI-KRAB.
b – схема, описывающая операцию ИЛИ между молекулярными входами А и B.
c – схема, соответствующая логическому отрицанию (операции НЕ) молекулярного входа А.
d – схема генной CNF-сети. Молекулярные входы – точечные линии и фигурки (A, B, C, E). CMV и CAG – промоторы (последовательности старта производства белка).

Рис. 2-2 - Дизайн генной сети молекулярного компьютера на основе СNF-формы

1.) Если репрессор эффективно регулирует выходные данные, все mRNA должны быть устранены, чтобы сгенерировать выходные данные, имплементируя логическую операцию И (таблица 2-2а). Если репрессор с одной мРНК эффективно блокирует белок dsRed , то для получения последнего на выходе необходимо, чтобы все мРНК, производящие репрессор, были удалены, что соответствует логической операции И (рис.2-2a).

2.)

Как и до этого, мы комбинируем комплекты целей siRNA. Однако, в отличие от прошлого случая, эндогенные входные данные должны активизировать siRNA, а не заблокировать их. ПО меньшей мере одна siRNA из каждого комплекта должна быть активизирована, чтобы устранить все репрессоры mRNA и деблокировать подавление, в соответствии с логической операцией ИЛИ (рис. 2-2б). Как и в схеме с DNF, последовательности-мишени для siRNA вставили в 3’-UTR участки мРНК, кодирующих репрессоры. Но, в противоположность предыдущей схеме, здесь предполагается, что молекулы на входе активируют siRNA, а не блокируют их. Хотя бы одна из двух siRNA, нацеленных на одну мРНК, должна быть активирована, чтобы уничтожить эту репрессорную мРНК (рис. 2-2b). Это приведет к освобождению LacO области от LacI и, соответственно, инициирует образование белка dsRed. Эта ситуация иллюстрирует логическую операцию ИЛИ (рис.2-2b).

3.) Например, если А и B активизируют siRNA, направленные на одну mRNA, а Х и Y активизируют siRNA, направленную на другую mRNA, как минимум A или B, а также X или Y должны присутствовать (A ИЛИ B; X ИЛИ Y). Данные, блокирующие медиатора- siRNA отсутствуют в выражении (рис. 2-2с). Это – пример выражения конъюнктивной нормальной формы (КНФ) – (рис. 2-2д). Стандартные формы ДНФ и КНФ особенно полезны, потому что любое логическое условие может быть оценено с использованием соответствующей ДНФ или КНФ. В случае с логическим отрицанием (рис.2c) предполагается, что молекулярный вход А блокирует siRNA. В этом случае, если А нет на входе (ЛОЖЬ – FALSE), тогда нет репрессора и есть белок dsRed, что соответствует операции НЕ (А), и на выходе мы имеем ИСТИНУ – TRUE.

Пример генной CNF-сети показан на рис.2-2d. Если молекулярные входы B и С присутствуют, тогда активируются siRNA-B и siRNA-C, снижая количества репрессора LacI, синтезируемого с молекул-операторов мРНК1 и мРНК2. При этом общий уровень белка LacI будет низким, что приведет к освобождению области LacO от LacI. Теперь участок старта синтеза белка dsRed открыт и на выходе имеем большие количества белка dsRed, что соответствует результату ИСТИНА.
Экспериментально эти генные схемы были реализованы в культурах клеток человеческих эмбриональных почек (293-Н). В эти клетки одновременно вводили гены, соответствующие используемой логической форме – DNF (рис.1d) или CNF (рис.1b,d), и имитировали действие входных сигналов добавлением или отсутствием соответствующих молекул siRNA. Выходные сигналы в виде количества соответствующих белков анализировали через 48 часов. Молекулы siRNA и их мишени сконструировали на основе известных последовательностей – T1 и T2 из морского кораллового полипа Renilla reniformis, FF3 и FF4 – из люцифераз светлячков и S14 из eGFP – зеленого флуоресцентного белка медузы.
флуоресцентного протеина).

2.4 Тестирование индивидуальных молекул

Далее проводились оценивающие эксперименты для выражение ДНФ и КНФ. Были сконструировали цепи, чтобы оценить два выражения в форме ДНФ. Так, для двух генных сетей, соответствующих двум DNF-формам, были просчитаны все варианты пяти входных переменных (табл.2-3а).

Рисунок 2-3 - Таблицы истинности для вычисляемых выражений

Форме D1 – (A И B И C ) ИЛИ (D И E) – соответствуют два молекулярных оператора. Один из них содержит в нетранслируемом конце гена ZsYellow последовательные мишени для siRNA, блокирующих синтез белков T1 (A), T2 (B) и S14 (C). В тот же участок второго гена-оператора встроены мишени для siRNA FF3 (D) и FF4 (E) (в соответствии с рис. 2-1d).
Форме D2 – (A И C И E) ИЛИ (НЕ(A) И B) – соответствуют молекулярный оператор 1, содержащий в нетранслируемом конце гена ZsYellow последовательные мишени для siRNA, блокирующих синтез белков FF4 (A), T1 (C) и S14 (E), и молекулярный оператор 2, содержащий мишени для siRNA, блокирующих синтез FF3 (НЕ(A)) и T2 (B) в том же

участке (в соответствии с рис.2-1d).
Та же siRNA (FF3) была по-разному использована в D1 и D2, один раз как переменная Е, а второй – как отрицаемая переменная НЕ(А). После прогонки всех возможных истинных значений для переменных в каждом выражении: 32 для D1, 16 для D2 (рис. 2-3а), распределение групп выходных данных продемонстрировало четкое разграничение между группами истинных и ложных данных. Оценивание выражения D1, когда все переменные истинны, а siRNA не присутствуют, привело к увеличению выходных данных более, чем в 2 раза. Высокое значение данных интерпретировано как истинное. Несмотря на то, что в выражении D2 было получено одно несовершенное оценивание ложности (A:T, B:F, C:F, E:T), увеличение количества siRNA SI4 от 2.5 pmol до 10 pmol, привело к улучшении подавления до 0.08 единиц.
Интенсивности флюоресценции (цифры справа от фотографий) соответствуют количеству синтезируемых выходных белков и показывают явное различие между группами «ЛОЖЬ» и «ИСТИНА» (в среднем в 16 раз), как и требуется в логическом выражении. В случае со всеми значениями переменных «ИСТИНА» в D1 (когда нет ни одной siRNA) количество выходного белка более чем вдвое превышало остальные положительные результаты, что отражало параллельный выход белков с обеих операторных мРНК.

Рисунок 2-4 - Тестирование индивидуальных молекул ДНК

а – результаты оценки двух DNF-выражений, полученные для всех комбинаций переменных.
Когда на входе siRNA имеют значения «–» (т.е. отсутствуют), то для одинакового общего количества siRNA во всех экспериментах в качестве негативного контроля использовали соответствующее количество нонсенсной siRNA (не имеющей здесь мишени). Цифры справа показывают суммарную интенсивность флуоресценции белка Zsyellow (зеленого цвета), отнесенную к интенсивности флуоресценции контрольного белка pAmCyan (красного цвета). Совместная экспрессия белков Zsyellow и pAmCyan дает сигналы от красного (при низкой экспрессии ZsYellow) до зеленого или желтого (при достаточно больших количествах ZsYellow).
b – оценка двух CNF-форм.
В форме C1 (D ИЛИ E) использовали молекулу-оператор CMV-LacI-FF3-FF4, содержащую мишени для siRNA FF3(D) и FF4(E), и регулируемый этой конструкцией белок dsRed в т.н. репортерной молекуле CAGOP-dsRed. Значения «ИСТИНА» отличаются от результатов «ЛОЖЬ» в форме C1 более чем в 3 раза. По сравнению с генной схемой DNF CNF-форма С1 работает не так эффективно (там количество репортерного белка различается в 16 раз). Поэтому авторы попытались увеличить разницу между «ИСТИНОЙ» и «ЛОЖЬЮ», действуя «на два фронта».
Чтобы сильнее подавить выработку репортерного белка dsRed, они взяли более сильный репрессор – LacI-KRAB, а в молекулу-оператор вставили вместо одной три последовательных мишени для siRNA FF3 и FF4: CMV-LacI-KRAB-FF3*3-FF4*3. Ожидалось, что утроение числа мишеней для репрессорных siRNA и усиленное подавление синтеза репортерного белка более активным репрессором заметно увеличат разницу между результатами, но это привело лишь к двукратному улучшению (разница в 6 раз).
В форме C2 авторы смоделировали операцию И – (D) И (E) (рис.2-2d): молекула-оператор CMV-LacI-FF3*3 с тремя мишенями для siRNA FF3 (D), молекула-оператор CMV-LacI-FF4*3 с тремя мишенями для siRNA FF4 (E) и репортерная молекула CAGOP-dsRed.
С2 принимает значение ИСТИНА только тогда, когда синтез репрессоров на обеих мРНК подавлен, т.е. когда присутствуют обе siRNA (FF3 и FF4) (рис. 2-2d и рис.2-3b). Здесь также разница между ИСТИНОЙ и ЛОЖЬЮ не очень велика (3 раза), но достоверна.