Учебно-методическое пособие Оренбург 2011 удк ббк л (стр. 42 из 49)

Среди них можно определить три основные группы:

· оценка свободнорадикального окисления липидов в сыворотке крови;

· содержание витаминов-антиоксидантов (А ,Е и С);

· активность основных ферментов антиоксидантной защиты (супероксиддисмутазы и каталазы).

Кроме того, могут быть определены дополнительные показатели:

· оценка липидного спектра в сыворотке крови;

· оценка активности органоспецифических ферментов в сыворотке крови.

3.1. Методы оценки эффективности защиты человека от воздействия приоритетных поллютантов

3.1.1 Метод оценки свободнорадикального окисления липидов

Для оценки интенсивности процессов свободнорадикального окисления липидов у обследованных лиц применяется спонтанная и железоиндуцированная хемилюминесценция цельной сыворотки крови.

Методика оценки свободнорадикального окисления липидов в цельной сыворотке крови

Для исследования хемилюминесценции цельной сыворотки крови необходимо забрать венозную кровь без ЭДТА и без гепарина. Выдержать 30 минут, после чего центрифугировать при 1500 об/мин в течение 15 минут. Полученную сыворотку развести фосфатным буфером рН=7,45. Состав буфера: 2,72 г KH2PO4, 7,82 г КСl на 1 литр дистиллированной воды. Величину рН полученного раствора, в соответствие с методикой, довести до 7,45 ед. титрованием насыщенным раствором КОН.

Определение спонтанной и железоиндуцированной хемилюминесценции проводят отобрав 0,5 мл полученной сыворотки крови разведенной в 20 мл фосфатного буфера. Пробу поместить в кюветную камеру прибора «Хемилюминометр-3». В пробу для инициирования свечения ввести 1 мл 25 мМ раствора сернокислого железа.

При оценке наблюдаемой вспышки хемилюминесценции выделить несколько основных параметров:

h - высоту быстрой вспышки, зависящую от содержания в изучаемой системе гидроперекисей липидов;

Н - высоту медленной вспышки, отражающую способность липидов к перекисному окислению, максимальную интенсивность ПОЛ после введения Fe²⁺;

S - светосумму медленной вспышки, определяемую как площадь под кривой от начала медленной вспышки до достижения ею максимального значения, оценивающую число боковых цепей разветвления, т.е. сколько на 1 ион Fe²⁺ приходится образовавшихся перекисных радикалов (RООя);

tg б – тангенс угла наклона медленной вспышки, определяет скорость окисления липидов; ф – латентный период (в с) от момента введения железа (II) до достижения концентрации Fe2+ критической величины, латентный период зависит от соотношения в системе про- и антиоксидантов.

Критерии оценки (показатели в пределах нормы):

Спонтанная светимость 0,27 - 0,37 у.е.,

Вспышка 0,77 – 0,87 у.е.,

Светосумма 2,70 - 3,10 у.е.,

Максимальная светимость 0,85 – 1,10 у.е.,

Наклон 0,24 – 0,32 у.е.

Исследование хемилюминесценции суммарной фракции апо-В ЛП (ЛПНП и ЛПОНП) сыворотки крови

Для исследования хемилюминесценции цельной сыворотки крови необходимо забрать венозную кровь без ЭДТА и без гепарина. Выдержать 30 минут, после чего центрифугировать при 1500 об/мин в течение 15 минут. Суммарную фракцию апо-В ЛП (ЛПНП и ЛПОНП) сыворотки крови выделить осаждением в присутствии гепарина и хлорида кальция двухвалентного. Для выделения фракции апо-В ЛП к 2 мл 15 мМ раствора CaCl₂ добавить 0,2 мл сыворотки крови и 0,04 мл 1% раствора кристаллического гепарина. Образовавшуюся суспензию инкубировать 5 минут при комнатной температуре. После инкубирования пробы центрифугировать пять минут при 2000g. Надосадочную жидкость удалять. Осадок представляет собой суммарную фракцию липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) и липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП). К осадку добавить 0,85% раствор хлорида натрия и гомогенизировать до образования суспензии апо-В ЛП.

Полученную суспензию в смеси с фосфатным буфером (1:8 мл) поместить в кювету хемилюминесцентной установки. Для инициирования свечения в пробу ввести 1 мл 25 мМ раствора сернокислого железа.

При оценке наблюдаемой вспышки хемилюминесценции выделить основные параметры:

h - высоту быстрой вспышки, зависящую от содержания в изучаемой системе гидроперекисей липидов;

Н - высоту медленной вспышки, отражающую способность липидов к перекисному окислению, максимальную интенсивность ПОЛ после введения Fe²⁺;

S - светосумму медленной вспышки, определяемую как площадь под кривой от начала медленной вспышки до достижения ею максимального значения, оценивающую число боковых цепей разветвления, т.е. сколько на 1 ион Fe²⁺ приходится образовавшихся перекисных радикалов (RООя);

tg б – тангенс угла наклона медленной вспышки, определяет скорость окисления липидов; ф – латентный период (в с) от момента введения железа (II) до достижения концентрации Fe2+ критической величины, латентный период зависит от соотношения в системе про- и антиоксидантов.

Критерии оценки (показатели в пределах нормы):

Спонтанная светимость 0,21 - 0,35 у.е.,

Вспышка 0,36 – 0, 50 у.е.,

Светосумма 1,70 - 2,70 у.е.,

Максимальная светимость 0,69 – 1,00 у.е.,

Наклон 0,18 – 0,32 у.е.

3.1.2 Метод оценки обеспеченности витаминами-антиоксидантами

Обеспеченность витаминами – антиоксидантами оценивается по концентрации витамина А и свободных токоферолов (витамина Е) в сыворотке крови флуориметрическим методом на анализаторе биожидкостей «ФЛУОРАТ-02 АБЛФ» фирмы «Люмекс» (Россия). Обеспеченность витамином С в моче оценивали титриметрическим методом (по Тильмансу).

Определение массовой концентрации витамина А в сыворотке крови на анализаторе биожидкости «ФЛУОРАТ-02 АБЛФ»

В две центрифужные пробирки помещается по 1 см³ дистиллированной воды и 1 см³ этанола. В первую поместить 1 см³ исследуемой сыворотки крови (образец №2). Во вторую - 1 см³ дистиллированной воды (образец №1). Встряхивать (аппарат типа «Vortex») 30 сeкунд. Добавить 5 см³ гексана и встряхивать в течение 1 минуты. После встряхивания пробы центрифугировать 10 минут при 1500 об/мин. Четко отделившийся гексановый слой использовать для флуориметрического определения.

Массовую концентрацию витамина А (Х, мкг/см³) в сыворотке крови вычисляют по формуле:

, где

С_изм – концентрация витамина А в экстракте (мкг/см³);

V_э – объем экстракта, см³;

V_c – объем сыворотки крови, взятой для анализа, см³;

Q – коэффициент, учитывающий разбавление экстракта.

Критерии оценки обеспеченности витамином А (показатели в пределах нормы):

0,3 – 0,7 мкг/см³

Определение массовой концентрации витамина Е в сыворотке крови на анализаторе биожидкости «ФЛУОРАТ-02 АБЛФ»

В две центрифужные пробирки помещается по 1 см³ дистиллированной воды и 1 см³ этанола. В первую поместить 1 см³ дистиллированной воды (образец №2). Во вторую - исследуемой сыворотки крови 1 см³ (образец №1). Встряхивать (аппарат типа «Vortex») 30 сeкунд. Добавить 5 см³ гексана и встряхивать в течение 1 минуты. После встряхивания пробы центрифугировать 10 минут при 1500 об/мин. Четко отделившийся гексановый слой использовать для флуориметрического определения.

Массовую концентрацию витамина Е (Х, мкг/см³) в сыворотке крови вычисляют по формуле:

, где

С_изм – концентрация витамина Е в экстракте (мкг/см³);

V_э – объем экстракта, см³;

V_c – объем сыворотки крови, взятой для анализа, см³;

Q – коэффициент, учитывающий разбавление экстракта.

Коэффициент разбавления равен

,

где Vк- объем разбавленного экстракта, см³;

V _разб.- объем исходного экстракта, взятый для разбавления, см³.

Критерии оценки обеспеченности витамином Е (показатели в пределах нормы):

8 – 12 мкг/см³

Определение содержания витамина С в моче

Определение количества аскорбиновой кислоты в моче дает представление об обеспеченности этим витамином в организма.

Суточная экскреция витамина С с мочой здорового человека составляет 20-30 мг (или 113,55-170,33 мк моль/ сутки). Это количество снижается при острых и хронических инфекционных заболеваниях, особенно у детей.

Для определения обеспеченности витамином С в две конические колбы необходимо отмерить по 10 мл мочи, 10 мл дистиллированной воды и 1 мл (20 капель) 10%-го раствора соляной кислоты. Содержимое каждой колбочки перемешать и оттитровать 0,001 н раствором 2,6-дихлорфенолиндо-фенолята натрия до появления розовой окраски, не исчезающей в течение 30 секунд.

Количество витамина С в моче рассчитывается по формуле:

где Х – количество аскорбиновой кислоты в моче (в мг/сутки);

0,088 – коэффициент, отражающий количество аскорбиновой кислоты, эквивалентное 1 мл 0,001 н раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия (в мг);

А – средняя арифметическая результатов титрования 0,001 н раствором краски Тильманса двух проб мочи (в мл);

В – среднее суточное количество мочи (для мужчин – 1500 мл, для женщин – 1200 мл);

Б – объем мочи, взятый для титрования (в мл).

Критерии оценки обеспеченности витамином С:

С мочой у здорового человека экскретируется 20–30 м г витамина С и ли 1 13,55–170,33 мкмоль/сут.

3.1.3 Метод оценки ферментативной защиты по изменению активности ферментов супероксиддисмутазы и каталазы

Венозную кровь для определения антиоксидантных ферментов необходимо собрать в пробирки с антикоагулянтом, в качестве которого использовать ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислоту) в количестве 1мг/мл.