Задачи 3 Обзор литературы Эукариоты 1 Животные и грибы 1 Виды пгк 3 1 Механизмы апоптоза (стр. 2 из 7)

-8-

активирует нуклеазу, разрывающую ядерную ДНК на крупные фрагменты длиной 50 тыс. пар нуклеотидов и более. Еще один проапоптозный белок митохондрий – SMAС (second mitochondrial apoptosis activating factor – второй митохондриальный фактор, активирующий апоптоз) вызывает активацию каспаз-3 и -9, связываясь с белками IAP, снимая их ингибирующее действие на каспазы. Также из митохондрий может высвобождаться эндонуклеаза G (EndoG) (Hail et al., 2006). Высвободившаяся EndoG транслоцируется в ядро и вызывает фрагментацию ДНК. Кроме того, появились данные о том, что цитохром с, помимо активации каспаз, вызывает конденсацию хроматина, экстернализацию фосфатидилсерина и уменьшение обьема клетки.

Апоптоз может инициироваться Са2+ (Самуилов, 2001). В ЭПР локализована прокаспаза-12, которая активируется при нарушении внутриклеточного Са2+-гомеостаза или накоплении избыточных количеств белка в ЭПР. Каспаза-12 активирует каспазу-3, приводящую в исполнение программу гибели клетки. Субстратом каспазы-3 является белок β -амилоид, накапливающийся в нейронах. Каспаза-3 разрушает β-амилоид с образованием цитотоксичного амилоидного β-пептида, который по механизму обратной связи усиливает превращение прокаспазы-3 в каспазу-3 и тем самым ускоряет гибель нейрона. Кроме того, нарушение Са 2+-гомеостаза приводит к активации калпаинов, эндонуклеаз и фосфолипаз, уменьшению обьема клетки, образованию мембранных выпячиваний и экстернализации фосфатидилсерина (Hail et al, 2006).

Апоптоз может запускаться RGD-пептидами (Самуилов, 2001). Несколько каспаз, включая каспазу-3, содержат RGD (аргинин–глицин–аспартат)-последовательность вблизи активного центра фермента. В молекуле прокаспазы эта последовательность вовлечена во внутримолекулярное взаимодействие, придающее молекуле профермента такую конформацию, при которой протеазная активность не может проявиться. Предположительно RGD-последовательность взаимодействует с последовательностью DDM (аспартат–аспартат–метионин), локализованной вблизи участка протеолитической активации прокаспазы-3. Низкомолекулярный RGD-пептид, проникая в клетку и вступая в конкурентные взаимоотношения с RGD-последовательностью прокаспазы-3, вытесняет ее из сферы взаимодействия с DDM-последовательностью молекул профермента и индуцирует изменение их конформации, олигомеризацию и аутопроцессинг прокаспазы-3 с образованием активной каспазы-3.

Апоптоз может включаться АФК и без участия митохондрий (Hail et al., 2006). Под их действием происходит выброс Са2+ из ЭПР (последствия см. выше), катепсинов из лизосом, экстернализация фосфатидилсерина и уменьшение обьема клетки.

4.1.1.2.2.Реализация апоптоза

-9-

Ранее считалось, что обязательным результатом инициации апоптоза является активация особых ферментов, называемых каспазами (Самуилов, 2001). Наряду с апоптозными имеются каспазы, которые активируют цитокины, участвующие в воспалительных процессах, – низкомолекулярные белки, посредники межклеточных взаимодействий (интерлейкины, γ-интерферон). Каспазы относятся к семейству эволюционно консервативных протеаз – ферментов, катализирующих ограниченное расщепление клеточных белков. Известны 14 членов семейства: каспаза-1, каспаза-2, каспаза-3 и т.д. В активном центре фермента – остаток цистеина. Все они специфически узнают определенные тетрапептидные звенья белков и расщепляют пептидную связь по карбоксильному концу остатка аспарагиновой кислоты. Слово "каспаза" происходит от английского "caspase", где буква "c" соответствует цистеину (cysteine), корень "asp" – аспартату (aspartate), "ase" – суффиксу в названиях ферментов. В клетке каспазы синтезируются в форме латентных предшественников – проферментов, называемых прокаспазами. По субстратной специфичности различают инициирующие и эффекторные каспазы или соответственно каспазы первого и второго эшелонов. Активация инициирующих прокаспаз происходит при участии специальных белков-адаптеров (см. рис. 2). На этапе активации каспаз первого эшелона жизнь клетки еще можно сохранить. Субстраты каспаз первого эшелона (к ним относятся каспазы-2, -8, -9, -10 и -12) – латентные формы каспаз второго эшелона – прокаспазы-3, -6, и -7.

Структурно прокаспаза (молекулярная масса до 50 кДа) состоит из трех звеньев: N-концевого звена (продомена), промежуточного домена, предшественника большой субъединицы (~20 кДа) и С-концевого домена, предшественника малой субъединицы (~10 кДа) зрелого фермента (рис. 5).Продомены инициирующих (а также воспалительных) прокаспаз содержат свыше 100 аминокислотных остатков. Они выполняют важную функцию в активации фермента: осуществляют взаимодействие прокаспаз с белками-адаптерами. В этих белок-белковых взаимодействиях участвуют специализированные участки продоменов, у разных прокаспаз это DED (death effector domain – домен эффектора смерти), CARD (caspase recruitment dоmain – домен рекрутирования каспазы), DID (death inducing domain – домен, вызывающий смерть). Так, у прокаспазы-9 это CARD, а у прокаспазы-8 два последовательно соединенных DED. Такие же домены имеются у адаптерных молекул, что позволяет реализовать междоменное, так называемое гомофильное взаимодействие между прокаспазой и адаптером – CARD–CARD, DED–DED. Продомены эффекторных прокаспаз короче, чем у инициирующих прокаспаз, содержат менее 30 аминокислотных остатков и выполняют функцию ингибитора активации прокаспаз. Выявлены белки (их обозначают IAP), которые, блокируя отщепление продомена эффекторных прокаспаз и тем самым подавляя их активацию, предотвращают апоптоз. Активация каспазы заключается в протеолитическом удалении продомена, разрыве связи между большой и малой субъединицами и последующей сборке из них гетеродимера. Два гетеродимера, связываясь друг с другом через малые субъединицы, образуют тетрамер – активную

-10-

форму каспазы, обладающую двумя идентичными каталитическими центрами (см. рис. 5).

Свыше 60 различных белков являются субстратами эффекторных каспаз. По функциональной принадлежности они разделяются на несколько групп. Во-первых,

подвергается протеолизу ингибитор ДНКазы, ответственной за фрагментацию ДНК. В нормальных клетках апоптозная ДНКаза CAD (сaspase-activated DNase – ДНКаза,

активируемая каспазой) образует неактивный комплекс с ингибитором CAD, обозначаемым ICAD или DFF (DNA fragmentation factor – фактор фрагментации ДНК). При апоптозе ингибитор ICAD с участием каспаз-3 или -7 инактивируется и свободная CAD, вызывая межнуклеосомальные разрывы хроматина, ведет к образованию фрагментов ДНК с молекулярной массой, кратной молекулярной массе ДНК в нуклеосомных частицах, – 180–200 пар нуклеотидов. Эти фрагменты при электрофоретическом разделении в агарозном геле дают характерную лесенку ДНК. Апоптоз возможен и без фрагментации ДНК;

Во-вторых, происходят инактивация и нарушение регуляции белков,

-11-

участвующих в репарации ДНК, сплайсинге мРНК, репликации ДНК. Мишенью каспаз является поли(АДФ-рибозо)полимераза (ПАРП). Этот фермент участвует в репарации ДНК, катализируя поли(АДФ-рибозилирование) гистонов и других белков, связанных с ДНК. Донором АДФ-рибозы является NAD+ (молекула NAD+ построена следующим образом: никотинамид–рибоза–фосфат–фосфат–рибоза–аденин, при отщеплении никотинамида образуется АДФ-рибоза). Активность ПАРП возрастает в 500 раз и более при связывании с участками разрыва ДНК. Апоптозная гибель клетки сопровождается расщеплением ПАРП каспазами.Чрезмерная активация ПАРП при массированных разрывах ДНК, сильно снижая содержание внутриклеточного NAD+, ведет к подавлению гликолиза и митохондриального дыхания и вызывает гибель клетки по варианту некроза;

В-третьих, разрушаются белки цитоскелета: ламины (структурные белки, выстилающие изнутри поверхность внутренней ядерной мембраны), актин, фодрин, кератины, а также фермент гельдолин, катализирующий деполимеризацию актина;

В-четвертых, модифицируются белки – регуляторы клеточного деления. Активируются циклинзависимые киназы, разрушаются белки (p21 и p27), подавляющие активность этих киназ;

В-пятых, разрушаются белки IAP;

В-шестых, модифицируются белки, участвующие в межклеточной сигнализации, ядерные факторы траскрипции. Наибольшей активностью в расщеплении этих белков обладает каспаза-3: считают, что после ее активации клетка необратимо теряет пути к выживанию.

Однако, было показано, что участие в реализации апоптоза каспаз вовсе необязательно, и что существуют и другие протеазы, задействованные в данном процессе (Hail et al., 2006). Это так называемые катепсины, калпаины и гранзимы, а также сериновая протеаза HtrA2/Omi. Семейство катепсиновых протеаз включает цистеиновые, аспартатные и сериновые протеазы. Наиболее часто при реализации апоптоза бывают задействованы катепсин В, катепсин L (оба цистеиновые протеазы) и катепсин D (аспартатная протеаза). Эти протеазы локализованы в лизосомах и эндосомах, но перемещаются в цитоплазму при апоптозе. Считается, что активность катепсинов приводит к повышению проницаемости митохондриальной мембраны, конденсации хроматина, деградации межклеточного матрикса, процессингу прокаспаз и экстернализации фосфатидилсерина плазматической мембраны.

Представители семейства калпаиновых цистеиновых протеаз находятся в цитоплазме. Как µ-, так и m-калпаин участвуют в реализации апоптоза. Калпаины активируются аномальным повышением внутриклеточной концентрации Са2+.

Гранзимы - это сериновые протеазы, структурно сходные с химотрипсином. Гранзимы расщепляют аминокислотные цепи после карбоксильной группы кислых аминокислотных остатков, особенно аспартатного. Гранзимы экскретируются при экзоцитозе, что позволяет натуральным киллерам индуцировать апоптоз в клетках-мишенях. Показано, что гранзимы участвуют во фрагментации ДНК, повышении