Задачи 3 Обзор литературы Эукариоты 1 Животные и грибы 1 Виды пгк 3 1 Механизмы апоптоза (стр. 4 из 7)

-16-

клеточных стенок самих растений. К элиситорам относятся арахидоновая и эйкозапентаеновая кислоты, хитозаны, элиситины (небольшие пептиды, продуцируемые Phytophthora и Pythium, например криптогеин), харпины (бактериальные белковые элиситоры), декстрины, называемые олигосахаринами (продукты гидролиза клеточных стенок растения, состоящие из нескольких остатков глюкозы).

CN- не является чужеродным для растений. Многие растения (клевер, вишня, слива, маниок и др.) содержат цианогенные гликозиды, защищающие их от фитопатогенов. У растений CN- может образовываться при деградации цианогенных гликозидов и при окислении 1-аминоциклопропан-1-карбоновой кислоты на конечном этапе биосинтеза этилена, при этом образуются этилен, HCN и СО2. Цианид ингибирует гемопротеины. В клетках растений CN- подавляет фотосинтетический и дыхательный (с участием цитохромоксидазы) перенос электронов, снижает активность каталазы и пероксидаз — ферментов, осуществляющих деградацию Н2О2. CN- вызывает ПГК у растений.

Сигналы, запускающие ПГК, поступают не только извне. Так, необратимые нарушения вторичной структуры белков клетки инициируют программу гибели. Денатурация белков вызывается тепловым, окислительным и солевым воздействиями, тяжелыми металлами, мутациями и нарушениями в системе экспрессии генов. Появление в клетке денатурированных белковых молекул активирует синтез особых белков — белков теплового шока (Hsp, heat shock proteins), к которым относят шапероны — семейство белков, восстанавливающих структуру денатурированных белков клетки. Нарушение вторичной структуры белков в клетке вызывает образование их комплексов с Hsp — шапероны восстанавливают правильную пространственную укладку белковых молекул. В связанном состоянии Hsp не могут подавлять апоптоз, и клетка погибает. Тепловой шок у растений запускает ПГК. ПГК, вызванная тепловой обработкой клеток табака, сопровождается усилением генерации АФК. При этом в клетках уменьшается активность аскорбатпероксидазы и нарушается работа митохондриальной электрон-транспортной цепи. Белки теплового шока предотвращают деградацию клеток растений и их компонентов. Снижение экспрессии гена белка Hsp 70, локализованного в хлоропластах одноклеточной водоросли хламидомонады, повышало чувствительность фотосистемы II к разрушительному действию интенсивного света, а сверхэкспрессия защищала ФС II от фотоингибирования. Мутация хлоропластного шаперонина 60β у A. thaliana вызывала ПГК.

Нарушения структуры ДНК, например при УФ-облучении, вызывают ПГК у растений. Ультрафиолет индуцирует ПГК у A. thaliana, при которой наблюдается олигонуклеосомная фрагментация ДНК и участие каспазоподобных протеаз.

Идентифицированы системы, передающие сигнал в ядро клетки, что вызывает активацию факторов транскрипции и экспрессию генов. Выявлено участие аденилатциклазной, МАР-киназной, фосфатидной, кальциевой, липоксигеназной,

-17-

NADPH-оксидазной, NO-синтазной, зависимой от Н+-помп сигнальных систем при ГО. Очевидно, в той или иной степени эти системы задействованы в ПГК. Считается, что наиболее важную роль в ПГК у растений играют кальциевая, липоксигеназная, NADPH-oксидазная, NO-синтазная и МАР-киназная системы (рис. 7).

Кальциевая сигнальная система активируется при повышении концентрации Са2+ в цитоплазме. Поступающий в клетку сигнал воспринимается рецептором. Связанный с ним регуляторный G-белок активирует фосфолипазу С, которая катализирует гидролиз фосфатидилинозитол-4,5-дифосфата в плазматической мембране с образованием диацилглицерола и инозитол-1,4,5-трифосфата. Инозитолтрифосфат вызывает мобилизацию Са2+ из внутриклеточных депо и из межклеточного пространства в цитоплазму. Накопление Са2+ в цитоплазме может стимулироваться АФК. Са2+ влияет на активность различных белков: у A. thaliana обнаружено около 250 белков, имеющих хотя бы одну Са2+-связывающую аминокислотную последовательность. Диацилглицерол и повышение концентрации Са2+ активирует протеинкиназу С, которая наряду с Са2+-зависимыми протеинкиназами вызывает активацию факторов транскрипции и экспрессию генов, инициирующих ПГК.

Действие липоксигеназной сигнальной системы характеризуется окислением полиненасыщенных жирных кислот. Различные сигналы активируют фосфолипазу А2, катализирующую высвобождение жирных кислот из мембранных фосфолипидов. Ненасыщенные жирные кислоты являются субстратами для

-18-

α-диоксигеназы, пероксидаз и липоксигеназ, окисляющих их. Окисление жирных кислот может осуществляться АФК. В результате окисления образуются гидроперекиси жирных кислот. Некоторые из них (оксилипины, например фитопростан, α-кетол, γ-кетол, травматиновая кислота, фитодиеновая кислота) играют роль клеточных метаболитов, регулирующих экспрессию генов. Из фитодиеновой кислоты могут синтезироваться жасмоновая кислота и метилжасмонат.

Основным метаболитом NADPH-оксидазного сигнального пути, включающегося, например, при ГО, является Н2О2. При ГО запускается каскад реакций (рис. 8), приводящий к гибели клетки, а также к образованию сигнальных соединений (Н2О2, салициловая кислота), активирующих различные защитные процессы в соседних клетках. Этот каскад включает вход в клетку Са2+ и Н+ и выход К+ и С1-.

Увеличение концентрации Са2+ в цитоплазме клетки вызывает активацию NADPH-oксидазы плазматической мембраны. Большая субъединица NADPH-оксидазы имеет две регуляторные Са2+-связывающие аминокислотные последовательности. Кроме того, существует непрямая активация кальцием NADPH-оксидазы: Са2+ активирует кальций-зависимую протеинкиназу (CDPK), индуцирующую

-19-

NADPH-оксидазу; Активация NADPH-оксидазы вызывает образование АФК — супероксидного аниона-радикала (O2-*) и Н2О2. Образование Н2О2 может идти и при участии пероксидазы клеточной стенки. При этом снижается экспрессия генов ферментов, утилизирующих Н2О2 — аскорбат-пероксидазы и каталазы. Н2О2 при ГО действует как сигнальное соединение, вызывающее гибель клеток растений и экспрессию генов устойчивости к патогену, как антисептик по отношению к патогену и как соединение, вызывающее упрочнение клеточных стенок в месте заражения (механический барьер для патогена, препятствующий его проникновению). Увеличение прочности клеточных стенок происходит за счет окисления пероксидом остатков тирозина в белках клеточной стенки и остатков фенольных соединений, входящих в состав лигнина, что вызывает их перекрестную сшивку. NADPH-оксидазная сигнальная система тесно связана с кальциевой и МАР-киназной системами передачи сигнала. Возможна непосредственная регуляция различных ферментов и факторов транскрипции пероксидом водорода. Окисление SH-гpyппы остатка цистеина с помощью O2-* или Н2О2 может приводить к изменению конформации, образованию дисульфидных мостиков и сшивке белков. Обычно такие изменения переводят ферменты в неактивное состояние, но есть белки, активность которых повышается при окислении. Важную роль в NADPH-оксидазном сигнальном пути играет салициловая кислота, ее концентрация в клетке при действии элиситоров или Н2О2 возрастает в десятки раз.

NO, образующийся из аргинина при активации NO-синтазы элиситорами патогенов, может играть роль сигнальной молекулы, вызывая синтез фитоалексинов и защитных белков. Предполагается, что передача сигнала в ядро происходит при активации оксидом азота гуанилатциклазы, которая катализирует образование cGMP из GTP. cGMP может активировать кальциевые каналы, повышая концентрацию Са2+ в цитоплазме, а также являться индуктором некоторых протеинкиназ, регулирующих экспрессию генов. NO способен нитрозилировать глутатион, низкомолекулярный антиоксидант, и различные белки. S-нитрозилирование глутатиона и белков может регулировать активность клеточных ферментов и транскрипцию генов. Оксид азота способен влиять на активность редокс-чувствительных факторов транскрипции и ряда ферментов. Фосфорилирование является наиболее универсальным механизмом передачи сигнала в ядро клетки.

МАР-киназная сигнальная система представляет собой каскад последовательно активирующихся протеинкиназ. Активация МАР-киназ коррелирует с образованием Н2О2. Каскад МАР-киназ запускается индукторами ПГК у растений (элиситорами различной природы, АФК, УФ-светом, солевым и тепловым шоком, салициловой кислотой, этиленом, ауксином). Геном A. thaliana кодирует около 20 различных МАР-киназ. Каскад МАР-киназ регулируется фосфатазами. МАР-киназы активируются при фосфорилировании остатков треонина и тирозина. Фосфатазы, катализируя дефосфорилированке МАР-киназ, деактивируют их.

Важную роль в ПГК у растений играют митохондрии. Многие считают их

-20-

центральными органеллами, реализующими ПГК. Митохондрии — АФК-генерирующие структуры. 1—3% электронного потока в митохондриях может быть мобилизовано на одноэлектронное восстановление О2 с образованием О2-*. В образовании АФК участвуют комплексы I и III дыхательной цепи. При апоптозе образование АФК в митохондриях существенно усиливается. В отличие от митохондрий животных, митохондрии растений имеют возможность устойчивого к ротенону переноса электронов с NAD(P)H, находящегося в матриксе или межмембранном пространстве, на убихинон, а также у них существует альтернативная оксидаза, осуществляющая перенос электронов с убихинона на 02. Несмотря на различия в структуре, митохондрии растений, подобно митохондриям животных, способны генерировать АФК. Зарегистрировано усиление митохондриального транспорта электронов и генерации АФК при ПГК у A. thaliana, вызванной окислительным стрессом. АО является антиоксидантным ферментом — повышение уровня АФК в клетках растений стимулирует перенос электронов с участием АО. Активация АО предотвращала программируемую гибель клеток табака. Митохондрии — источники факторов, индуцирующих ПГК. Менадион (АФК-генерирующий агент) вызывал высвобождение цитохрома с из митохондрий в цитозоль и гибель протопластов табака. Наблюдались нарушение проницаемости митохондриальной мембраны (открытие РТР) и выход цитохрома с при ПГК у A. thaliana, вызванного Н2О2. Высвобождение цитохрома с из митохондрий происходило при гарпин-индуцированной гибели культуры клеток A. thaliana. Токсин викторин стимулировал открытие РТР-пор в клетках овса. NO индуцировал ПГК, сопровождающуюся падением митохондриального мембранного потенциала у растений, которое предотвращалось циклоспорином А — ингибитором образования РТР. Озон вызывал выход цитохрома с из митохондрий клеток табака, активацию протеаз и фрагментацию ДНК. Мутация у подсолнуха индуцировала высвобождение цитохрома с в цитоплазму, происходившее до характерных морфологических изменений в клетках. Тем не менее пока остается неясно, является ли высвобождение цитохрома с ключевым событием в ПГК у растений, запускающим гибель клеток, или же это — лишь результат деградации митохондрий в конечной стадии ПГК. В межмембранном пространстве митохондрий растений локализуется Mg2+-зависимая эндонуклеаза, осуществляющая разрезание ядерной ДНК на фрагменты длиной ~ 30 тыс. п.н. Эта эндонуклеаза, по-видимому, является аналогом эндонуклеазы G. Гомологи белков семейства Bcl-2 у растений не найдены, однако экспрессия гена белка Вах, вызывающего образование РТР, стимулирует ПГК, фенотипически сходную с гибелью клеток при ГО. Экспрессия генов антиапоптозных белков Bсl-2 и BcI-xL у табака предотвращала гербицид-индуцированную ПГК. Отмечена накопление этих белков в митохондриях и хлоропластах.