Для выполнения работ по визуализации и идентификации наночастиц в сточных и грунтовых водах объектами исследований служат пробы воды, взятые на очистных сооружения промышленных городов или предприятий, пробы стоков, отобранные из канализации предприятий, а также пробы грунтовых вод, отобранные в близи промышленных предприятий.
Целью является определение наличия наночастиц в сточных и грунтовых водах, проведение структурной и морфометрической идентификации наночастиц в воде.
Для электронно-микроскопической визуализации и идентификации наночастиц в сточных и грунтовых водах пробоотборником отбирают по 1-2 л воды. Каждую пробу воды выливают в химически чистую колбу со шлифом вместимостью 2-3 л. Каждую пробу воды фильтруют через 5-6 слоев обеззоленных фильтров. Фильтрат выливают в химически чистую круглодонную колбу. Затем колбу, соединенную с водоструйным или роторным вакуумным насосом, помещают на водяную баню и при температуре 80-90 ºС выпаривают воду до объема 10-20 см3. Пробы фильтрата после выпаривания используют для приготовления негативно-окрашенных препаратов для электронно-микроскопической визуализации и идентификации наночастиц (см. п. 6.4.6.1). Осадок с фильтра препарируют для исследования в электронном микроскопе методом ультратонких срезов (п. 6.4.6.2.).
6.4.6.1. Электронно-микроскопическая визуализация и идентификация наночастиц в сточных и грунтовых водах методом негативно-окрашенных препаратов
Схема проведения экспериментов по электронно-микроскопической визуализации и идентификации наночастиц в сточных и грунтовых водах представлена в таблице 8.
Таблица 8.
Схема проведения экспериментов по электронно-микроскопической визуализации и идентификации наночастиц в сточных и грунтовых водах методом негативно окрашенных препаратов.
| Объект исследования | Грунтовые и сточные воды |
| Физическая форма | Жидкость (суспензия воды, содержащая органические и неорганические примеси) |
| Количество материала для выполнения исследований | 10-20 см3 фильтрата сточной (грунтовой) воды, полученного после медленного выпаривания 1-2 л фильтрата сточной воды |
| Приборное обеспечение | Пробоотборник воды, роторный вакуумный насос или водоструйный насос, водяная баня, электронный микроскоп по п.6.1.1. |
| Материалы | Круглодонные колбы вместимостью 2 или 3 л со шлифом, обеззоленные фильтры, пинцет для электронно-микроскопических работ, электронно-микроскопические сеточки, пластинка тефлона размером 10×20 см, микропипетка вместимостью 50 мм3, наконечники к микропипетке, колбы вместимостью 100 см3, пробирки вместимостью 20 см3, пипетки |
| Химические реактивы | Формвар, коллодий, амилацетат, дихлорэтан, уранилацетат, дистиллированная вода |
| Препарирование образцов для исследования в электронном микроскопе | Этап 1 (подготовка реактивов и материалов к эксперименту): – приготовление 0,15 % раствора формвара на дихлорэтане или 0,5 % раствора коллодия на амилацетате; – покрытие электронно-микроскопических сеточек формваровой (коллодиевой) пленкой; – приготовление 1,0 % раствора уранилацетата. Этап 2 (препарирование образцов для электронной микроскопии): – пробы сточной (грунтовой) воды фильтруют через 5-6 слоев обеззоленных фильтров, фильтрат выливают в химически чистые колбы, соединенные с роторным вакуумным насосом или водоструйным насосом, фильтрат выпаривают на водяной бане при температуре 80-90 ºС до уменьшения первоначального объема в 1000-2000 раз. – пробы концентрированного фильтрата выпариванием наносят на электронно-микроскопические сеточки, покрытые формваровой (коллодиевой) пленкой; – при необходимости сеточки контрастируют 1,0 % раствором уранилацетата |
| Исследование проб воды в просвечивающем электронном микроскопе | Согласно п.6.3. |
| Анализ электронно-микроскопических изображений структуры наноматериала (продукта) в пробах воды | Основные этапы: – визуализация наночастиц в структуре воды; – морфометрический анализ наночастиц; – определение степени полиморфизма наночастиц в воде; – определение степени агрегированности наночастиц в воде |
| Основные параметры и характеристики наноматериала в сточных (грунтовых) водах для выдачи заключения | Структурные и морфометрические характеристики наноматериала: – наличие частиц размерами 1,0-100,0 нм в образце; – уровень электронно-оптической плотности частиц; – форма частиц; – коэффициент формы наночастиц; – степень полиморфизма наночастиц в воде; – степень агрегированности наночастиц в воде; – характер распределения наночастиц в воде |
Результаты и заключение электронно-микроскопической визуализации и идентификации наночастиц в пробах сточных (грунтовых) вод содержат информацию о форме, структуре и размерах наночастиц в исследуемых пробах воды, данные о степени агрегированности наночастиц, сведения о характере распределения наночастиц в образцах, электронно-микроскопические изображения частиц в воде.
6.4.6.2. Электронно-микроскопическая визуализация и идентификация наночастиц в сточных и грунтовых водах методом ультратонких срезов
Схема проведения экспериментов электронно-микроскопической визуализации и идентификации наночастиц в твердой фракции сточных и грунтовых вод представлена в таблице 9.
Таблица 9.
Схема проведения экспериментов по электронно-микроскопической визуализации и идентификации наночастиц твердой фракции сточных и грунтовых вод
| Вид исследуемого материала | Твердая фракция сточных и грунтовых вод или осадок |
| Физическая форма исследуемого материала | Осадок (влажная биомасса гидробионтов и микроорганизмов) |
| Количество материала для выполнения исследований | 100-150 мг влажной биомассы биопленки |
| Приборное обеспечение | Электронный микроскоп по п.6.1.1.; дополнительное оборудование по п.6.2.4. |
| Материалы | Пинцет для электронно-микроскопических работ, электронно-микроскопические сеточки, пластинка тефлона размером 10×20 см, микропипетка вместимостью 50 мм3, наконечники к микропипетке, колбы вместимостью 100 см3, пробирки вместимостью 20 см3, пипетки |
| Химические реактивы | Глутаровый альдегид, четырехокись осмия, какодилат натрия, этиловый спирт, абсолютный этиловый спирт или 100,0 % ацетон, эпоксидные смолы (аралдит или эпон), формвар, коллодий, амилацетат, дихлорэтан, уранилацетат, цитрат свинца, дистиллированная вода |
| Препарирование образцов для исследования в электронном микроскопе | Этап 1(подготовка реактивов и материалов к эксперименту): – приготовление 4,0 % раствора глутарового альдегида на 0,01 моль какодилатном буфере (рН 7,2); – прготовление 2,0 % раствора четырехокиси осмия на 0,01 моль какодилатном буфере (рН 7,2); – приготовление батареи спиртов возрастающей концентрацией; – приготовление смеси абсолютного спирта и эпоксидной смолы (аралдита); – заливочная эпоксидная смола; – приготовление 0,15 % раствора формвара на дихлорэтане или 0,5 % раствора коллодия на амилацетате; –покрытие электронно-микроскопических сеточек формваровой (коллодиевой) пленкой; – приготовление 1,0 % раствора уранилацетата; приготовление раствора цитрата свинца; приготовление эпоксидной смолы Этап 2 (препарирование образцов для электронной микроскопии): – пробы осадка фиксируют и инактивируют в 4,0 % растворе глутарового альдегида на 0,01 моль какодилатном буфере (рН 7,2); – образцы дофиксируют в 2,0 % растворе четырехокиси осмия на 0,01 моль какодилатном буфере (рН 7,2); – образцы дегидратируют в нескольких сменах этилового спирта с возрастающей концентрацией, образцы выдерживают в трех сменах абсолютного этилового спирта или ацетона; – образцы пропитывают в трех сменах абсолютного этилового спирта и аралдита; – образцы заключают в аралдит и полимеризуют в течение 72 час при температуре 60 ºС; – на ультрамикротоме стеклянным ножом из образцов осадка сточных (грунтовых) вод получают ультратонкие срезы толщиной 30,0-60,0 нм; – ультратонкие срезы монтируют на электронно-микроскопические сеточки, покрытые формваровой пленкой; – ультратонкие срезы наноматериала окрашивают цитратом свинца и 1,0 % раствором уранилацетата |
| Исследование ультраструктуры осадка сточных (грунтовых) вод в просвечивающем электронном микроскопе | Согласно п.6.3. |
| Анализ электронно-микроскопических изображений ультраструктуры осадка сточных (грунтовых) вод, содержащего наноматериалы | Основные этапы: – визуализация наночастиц на ультратонких срезах осадка сточных (грунтовых) вод; – морфометрический анализ наночастиц в структуре осадка сточных (грунтовых) вод и клеток гидробионтов, микроорганизмов; – определение степени полиморфизма наночастиц в структуре осадка сточных (грунтовых) вод и клеток микроорганизмов; – оценка степени загруженности гидробионтов и микробов наночастицами (число наночастиц на одну клетку); – диагностика структурных патологий в микробах; – определение числа микробов в осадке с летальными повреждениями и др. |
| Основные параметры и характеристики наночастиц (наноматериала) в структуре осадка сточных (грунтовых) вод для выдачи заключения | Структурные и морфометрические характеристики наноматериала: – наличие частиц размерами 1,0-100,0 нм в осадке сточных (грунтовых) вод; – уровень электронно-оптической плотности наночастиц; – форма наночастиц; – коэффициент формы наночастиц; – степень полиморфизма наночастиц в материале; – степень агрегированности наночастиц в образце; – степень загруженности микробов наночастицами; – характер повреждений ультраструктуры микробов наночастицами; –количество микробов в осадке с интактной ультраструктурой; – число микробов в осадке с летальными повреждениями и др. |
Результаты и заключение электронно-микроскопической визуализации и идентификации наночастиц в структуре осадка сточных (грунтовых) вод содержат информацию о форме, структуре и размерах наночастиц в исследуемом материале, данные о степени агрегировнности наночастиц, сведения о характере распределения наночастиц в образцах, число частиц на один микроб, характер и степень повреждения микроорганизмов наночастицами, электронно-микроскопические изображения наночастиц, осадка и микробов.