В структуре почвы, грунта и донных отложений содержатся органические вещества, минералы, вода, живые организмы и микроорганизмы. В почве, грунте и донных отложениях накапливаются продукты хозяйственной деятельности человека такие, как неорганические и органические вещества, продукты их распада, наноматериалы, токсиканты и т. д.
Целью является определение наличия наночастиц в структуре почвы, грунта и донных отложений, проведение структурной и морфометрической идентификации наночастиц в структуре почвы (грунта и донных отложений) и в тонкой структуре композиционных элементов почвы (грунта и донных отложений), живых микроорганизмах (бактериях, дрожжах, грибах и одноклеточных водорослях).
Образцы почвы (грунта и донных отложений) объемом 1 дм3 суспензируют в 1-2 л дистиллированной воды. Затем полученную суспензию фильтруют через 2-3 слоя медицинской марли для удаления крупных и твердых частиц почвы. Полученный фильтрат дополнительно фильтруют через 5-6 слоев обеззоленных фильтров. Фильтрат выливают в круглодонную химически чистую колбу. Затем колбу, соединенную с водоструйным или роторным вакуумным насосом помещают на водяную баню и при температуре 80-90 ºС выпаривают воду до объема 10-20 см3. Пробы фильтрата после выпаривания используют для приготовления негативно-окрашенных препаратов для электронно-микроскопической визуализации и идентификации наночастиц в растворимой фракции почвы (грунта и донных отложений) (см. п. 6.4.7.1). Осадок с фильтра используют для препарирования ультратонких срезов для электронно-микроскопической визуализации и идентификации наночастиц в твердой фракции почвы (грунта, донных отложений) (п. 6.4.7.2.).
6.4.7.1. Электронно-микроскопическая визуализация и идентификация наночастиц в водорастворимой фракции почвы (грунта, донных отложений) методом негативно-окрашенных препаратов
Схема проведения экспериментов по электронно-микроскопической визуализации и идентификации наночастиц в растворимой фракции почвы (грунта, донных отложений) представлена в таблице 10.
Таблица 10.
Схема проведения экспериментов по электронно-микроскопической визуализации и идентификации наночастиц в растворимой фракции почвы (грунта, донных отложений) методом негативно окрашенных препаратов.
| Объект исследования | Водная суспензия почвы (грунта, донных отложений) |
| Физическая форма | Жидкость (водорастворимая фракция почвы (грунта, донных отложений) |
| Количество материала для выполнения исследований | 10-20 см3 фильтрата, полученного после медленного выпаривания 1-2 л фильтрата водорастворимой фракции почвы (грунта, донных отложений) |
| Приборное обеспечение | Пробоотборник воды, роторный вакуумный насос или водоструйный насос, водяная баня, электронный микроскоп по п.6.1.1. |
| Материалы | Круглодонные колбы вместимостью 2 или 3 л со шлифом, обеззоленные фильтры, пинцет для электронно-микроскопических работ, электронно-микроскопические сеточки, пластинка тефлона размером 10×20 см, микропипетка вместимостью 50 мм3, наконечники к микропипетке, колбы вместимостью 100 см3, пробирки вместимостью 20 см3, пипетки |
| Химические реактивы | Формвар, коллодий, амилацетат, дихлорэтан, уранилацетат, дистиллированная вода |
| Препарирование образцов для исследования в электронном микроскопе | Этап 1 (подготовка реактивов и материалов к эксперименту): – приготовление 0,15 % раствора формвара на дихлорэтане или 0,5 % раствора коллодия на амилацетате; – покрытие электронно-микроскопических сеточек формваровой (коллодиевой) пленкой; – приготовление 1,0 % раствора уранилацетата. Этап 2 (препарирование образцов для электронной микроскопии): – пробы почвы (грунта, донных отложений) 1 дм3 суспензируют в 1-2 л дистиллированной воды; полученную суспензию фильтруют через несколько слоёв марли для удаления крупных нерастворимых частиц почвы; первичный фильтрат суспензии почвы фильтруют через 5-6 слоев обезоленных фильтров; фильтрат выливают в химически чистые колбы, соединенные с роторным вакуумным насосом или водоструйным насосом, выпаривают на водяной бане при температуре 80-90 ºС до уменьшения объема пробы воды в 500-1000 раз. – после выпаривания пробы из растворимой фракции почвы (грунта, донных отложений) наносят на электронно-микроскопические сеточки, покрытые формваровой (коллодиевой) пленкой; – сеточки контрастируют 1,0 % раствором уранилацетата |
| Исследование проб растворимой фракции почвы (грунта, донных отложений) в просвечивающем электронном микроскопе | Согласно п.6.3. |
| Анализ электронно-микроскопических изображений структуры наноматериала (продукта) в пробах растворимой фракции почвы (грунта, донных отложений) | Основные этапы: – визуализация наночастиц в растворимой фракции почвы (грунта, донных отложений); – морфометрический анализ наночастиц; – определение степени полиморфизма наночастиц в растворимой фракции почвы (грунта, донных отложений); – степень агрегированности наночастиц в растворимой фракции почвы (грунта, донных отложений) |
| Основные параметры и характеристики наноматериала в растворимой фракции почвы (грунта, донных отложений) для выдачи заключения | Структурные и морфометрические характеристики наноматериала: – наличие частиц размерами 1,0-100,0 нм в образце; – уровень электронно-оптической плотности частиц; – форма частиц; – коэффициент формы наночастиц; – степень полиморфизма наночастиц в растворимой фракции почвы (грунта, донных отложений); – степень агрегированности наночастиц в растворимой фракции почвы (грунта, донных отложений) – характер распределения наночастиц в растворимой фракции почвы (грунта, донных отложений) |
6.4.7.2. Электронно-микроскопическая визуализация и идентификация наночастиц в образцах почвы (грунта, донных отложений) методом ультратонких срезов
Схема проведения экспериментов электронно-микроскопической визуализации и идентификации наночастиц в нерастворимой фракции почвы (грунта, донных отложений) методом ультратонких срезов представлена в таблице 11.
Таблица 11.
Схема проведения экспериментов по электронно-микроскопической визуализации и идентификации наночастиц в тонкой структуре нерастворимой фракции почвы (грунта, донных отложений) методом ультратонких срезов
| Вид исследуемого материала | Нерастворимая фракция почвы (грунта, донных отложений) |
| Физическая форма исследуемого материала | Влажная масса |
| Количество материала для выполнения исследований | 100-150 мг влажной массы (осадка) |
| Приборное обеспечение | Электронный микроскоп по п.6.1.1.; дополнительное оборудование по п.6.2.4. |
| Материалы | Пинцет для электронно-микроскопических работ, электронно-микроскопические сеточки, пластинка тефлона размером 10×20 см, микропипетка вместимостью 50 мм3, наконечники к микропипетке, колбы вместимостью 100 см3, пробирки вместимостью 20 см3, пипетки |
| Химические реактивы | Глутаровый альдегид, четырехокись осмия, какодилат натрия, этиловый спирт, абсолютный этиловый спирт или 100,0 % ацетон, эпоксидные смолы (аралдит или эпон), формвар, коллодий, амилацетат, дихлорэтан, уранилацетат, цитрат свинца, дистиллированная вода |
| Препарирование образцов для исследования в электронном микроскопе | Этап 1(подготовка реактивов и материалов к эксперименту): – приготовление 4,0 % раствора глутарового альдегида на 0,01 моль какодилатном буфере (рН 7,2); – приготовление 4,0 % раствора четырехокиси осмия на 0,01 моль какодилатном буфере (рН 7,2); – приготовление батареи спиртов возрастающей концентрацией; – приготовление смеси абсолютного спирта и эпоксидной смолы (аралдита); – заливочная эпоксидная смола; – приготовление 0,15 % раствора формвара на дихлорэтане или 0,5 % раствора коллодия на амилацетате; – покрытие электронно-микроскопических сеточек формваровой (коллодиевой) пленкой; – приготовления 1,0 % раствора уранилацетата; приготовление раствора цитрата свинца; приготовление эпоксидной смолы Этап 2 (препарирование образцов для электронной микроскопии): – образцы фиксируют в 4,0 % растворе глутарового альдегида на 0,01 моль какодилатном буфере (рН 7,2); – пробы дофиксируют в 2,0 % растворе четырехокиси осмия на 0,01 моль какодилатном буфере (рН 7,2); – образцы дегидратируют в нескольких сменах этилового спирта с возрастающей концентрацией, образцы выдерживают в трех сменах абсолютного этилового спирта или ацетона; – образцы пропитывают в трех сменах абсолютного этилового спирта и аралдита; – образцы заключают в аралдит и полимеризуют в течение 72 час при температуре 60 ºС; – на ультрамикротоме стеклянным ножом из образцов нерастворимой фракции почвы (грунта, донных отложений) получают ультратонкие срезы толщиной 30,0-60,0 нм; – ультратонкие срезы монтируют на электронно-микроскопические сеточки, покрытые формваровой пленкой; – ультратонкие срезы наноматериала окрашивают цитратом свинца и 1,0 % раствором уранилацетата |
| Исследование ультраструктуры нерастворимой фракции почвы (грунта, донных отложений) в просвечивающем электронном микроскопе | Согласно п.6.3. |
| Анализ электронно-микроскопических изображений ультраструктуры осадка сточных (грунтовых) вод, содержащего наноматериалы | Основные этапы: – визуализация наночастиц на ультратонких срезах нерастворимой фракции почвы (грунта, донных отложений); – морфометрический анализ наночастиц в структуре нерастворимой фракции почвы (грунта, донных отложений); – определение степени полиморфизма наночастиц в структуре нерастворимой фракции почвы (грунта, донных отложений); – определение степени агрегированности наночастиц в структуре нерастворимой фракции почвы (грунта, донных отложений) |
| Основные параметры и характеристики наночастиц (наноматериала) в структуре нерастворимой фракции почвы (грунта, донных отложений) для выдачи заключения | Структурные и морфометрические характеристики наноматериала: – наличие частиц размерами 1,0-100,0 нм в нерастворимой фракции почвы (грунта, донных отложений); – уровень электронно-оптической плотности частиц; – форма частиц; – коэффициент формы наночастиц; – структура рельефа поверхности частиц; – степень полиморфизма наночастиц в материале; – степень агрегированности наночастиц в нерастворимой фракции почвы (грунта, донных отложений) |
На экране электронного микроскопа, затем на электронных микрофотографиях (изображениях) образца определяют следующие структурные и морфометрические характеристики наночастиц в нерастворимой фракции почвы (грунта, донных отложений):